[发明专利]一种对抗体具有广谱吸附能力的融合蛋白制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种对抗体具有广谱吸附能力的融合蛋白AG的制备方法及其在抗体纯化和血液净化等领域中的应用。 

背景技术

自身免疫性疾病(Autoimmune diseases，AID)是在特定情况下，机体自身耐受机制遭到破坏，免疫系统将自身的物质错误地识别为外来有害物质，致使自身抗体和自身反应性T淋巴细胞识别并损害机体自身正常细胞、组织、器官，从而导致一系列病变。由于自身抗体和免疫复合物在自身免疫性疾病中的致病性已被证实，通过吸附剂体外清除的方式降低病人血液中自身抗体和免疫复合物的浓度能够明显改善症状，对疾病可以起到缓解和治疗作用，在临床中已得到广泛应用。 

蛋白A免疫吸附柱是目前在自身免疫性疾病治疗中用量最大、治疗效果最好的吸附柱。 和 是两种最常用的蛋白A类免疫吸附柱，二者均获得了美国食品药品管理局(FDA)认证，广泛用于治疗免疫球蛋白相关疾病。 

蛋白A免疫吸附柱的关键成分是功能基蛋白A。蛋白A(Staphylococcus aureus proteinA，SPA)是金黄色葡萄球菌细胞壁的组分，占整个细胞壁蛋白的6.7%，以共价键的形式与胞壁肽聚糖相结合，分子量为42kDa，等电点pH 5.1，易被同位素碘所标记，对热和变性因子稳定，其分子含4个酪氨酸残基，无色氨酸。不含有半胱氨酸，所以分子中不含有二硫键。蛋白A分为三个部分：信号肽序列（S），五个高度同源的IgG结合结构域(E、D、A、B、C)以及锚定蛋白结构域（X）。蛋白A能与人及多种哺乳动物血清IgG中的Fc片段结合，但亲和性各不相同，具有种系选择性。此外，其还能与血清中少量的IgM和IgA结合。同时，蛋白A与人不同类型免疫球蛋白的结合能力也不同，其对IgG的结合率为95%(IgG₁100%，IgG₂100%，IgG₄100%，IgG₃35%)，IgM 51%，IgA 14%，IgE 7%。ProteinA的结构域示意图（如图6） 

然而蛋白A免疫吸附剂在30年的临床应用中也存在一些弊端，譬如其与人IgG₃结合力较弱，对于一些致病抗体包含IgG₃的疾病如系统性红斑狼疮、扩张性心肌炎等疾病效果不显著。为了克服蛋白A吸附剂的上述缺陷，本发明将一段与人IgG₃具有较强结合能力的蛋白G 的基因与蛋白A的抗体结合结构域基因相连接，实现AG融合蛋白的重组表达，进而制备的融合蛋白AG吸附剂将弥补蛋白A吸附剂对IgG₃结合力弱的不足，提高其对系统性红斑狼疮、扩张性心肌炎等疾病的治疗效果。 

链球菌蛋白G（Streptococcus protein G，SPG）是一种存在于A、C、G群链球菌的细胞壁的蛋白，完整的蛋白分子量为64~65kDa，对热比较稳定，分子结构中没有二硫键，呈长纤维状。蛋白G分子中包含两至三个序列高度同源的免疫球蛋白结合域（C1、C2、C3），位于分子的C末端，其单结构域由两对反向平行的β片层和中间的一个α螺旋组成。其分子中还包含有信号肽（S）、白蛋白结合结构域(A、B)以及细胞壁锚定蛋白结构域（W、M）。蛋白G具有与人和哺乳动物IgG结合的能力，与人IgG的4个亚类均具有较强结合能力，包括IgG₃，但不与IgA、IgM、IgD和IgE结合。研究表明，完整的蛋白G分子可与人IgG的Fc片段以及Fab片段同时结合，还可与人血清白蛋白结合。蛋白G已广泛用作免疫学试剂，主要应用于免疫学探针以及IgG的纯化。Protein G的结构域示意图（如图7） 

可以看出，蛋白A与蛋白G在功能上具有互补性，两者的融合蛋白具有更好的结合特性，既可以弥补蛋白A对于IgG₃结合力弱的不足，又可以弥补蛋白G不结合其它类型免疫球蛋白的不足，是更为理想的免疫球蛋白结合蛋白。融合蛋白AG结构示意图（如图8）