[发明专利]一种用于测定GLP-1及其功能类似物生物活性的细胞株及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达胰高血糖素样肽-1受体蛋白的基因工程细胞株的建立，以及基于此细胞株受到胰高血糖素样肽-1及其功能类似物刺激后cAMP水平的变化来测定胰高血糖素样肽-1及其功能类似物生物活性的检测方法，属于药物生物活性检测技术领域。

背景技术

胰高血糖素样肽-1（Glucogan like Peptide-1, GLP-1）作用于胰岛β细胞胰高血糖素样肽-1受体（Glucogan like Peptide-1 Receptor，GLP-1R），促进胰岛素基因的转录、胰岛素的合成和分泌，并可刺激胰岛β细胞的增殖和分化，抑制胰岛β细胞凋亡，增加胰岛β细胞数量。研究证明，GLP-1可通过多种机制明显地改善2型糖尿病动物模型或患者的血糖情况，这为2型糖尿病的治疗提供了一个非常好的前景。

促胰岛素分泌肽（Exendin-4）是从生长在美国西南部和墨西哥沙漠的希拉毒蜥（Gila monster）唾液发现的一种多肽物质，氨基酸序列的53%与人类血液中调控血糖的GLP-1同源。Exendin-4同样是GLP-1R激动剂，与GLP-1功能相似，具有促进胰腺分泌胰岛素，促进机体对血糖的利用、减少肝糖原分解、通过减缓胃肠道的蠕动使食物的吸收减慢，从而降低食物中的葡萄糖在血液内出现的高峰，达到降低血糖作用。此外，它还有通过作用于中枢神经系统控制食欲等多种生理功能。由于Exendin-4不被二肽基肽酶－IV降解，其稳定性明显高于GLP-1。由美国Lilly公司和Amylin公司研制的Exendin-4(Byetta^? )，2005年获得了美国FDA批准用于治疗2型糖尿病全新类型的药物。在生理条件下，Byetta^?和GLP-1作用相似，它刺激胰岛素分泌的作用受血糖浓度的调节，血糖浓度降低时其刺激作用减轻或消失，因而不会出现胰岛素持续分泌而发生低血糖的现象，并有明显减少2型糖尿病肥胖患者体重的作用。然而，Exendin-4在人体内的半衰期为数小时，患者还是需要每天注射Byetta^?两次，使用上仍然相当不方便。目前正在研究具有长效治疗效果的GLP-1、Exendin-4药物。治疗糖尿病的长效蛋白质药物在保持降糖活性的同时可以延长药物在体内的半衰期，不仅可以减少注射频率，方便患者使用，同时还可达到降低治疗费用之目的。

建立有效的GLP-1及其功能类似物生物活性的测定方法，是评价新药药效的关键措施之一。目前，国内GLP-1及其功能类似物活性检测依然依赖于传统的动物测定方法。其检测方法存在实验动物不易获得，操作复杂，数据重复性差，检测方法难于标准化等缺点。本发明采用基因工程技术，构建了一个能稳定表达GLP-1R的基因工程人胚肾HEK293细胞株（GLP-1R/HEK293），建立了基于检测GLP-1R/HEK293细胞株在受到外来刺激后细胞中环磷酸腺苷（Cyclic Adenosine monophosphate，cAMP）含量的变化来测定外来刺激中GLP-1、Exendin-4及其功能类似物生物活性的检测方法，检测方法易标准化，重复性好，具有成本低、方便、准确的特点，因而具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于在体外测定GLP-1及其功能类似物生物活性的基因工程细胞株GLP-1R/HEK293。GLP-1R/HEK293细胞株的工作原理是：GLP-1R/HEK293细胞株能在细胞膜上稳定表达GLP-1R蛋白，该受体蛋白受到GLP-1及其功能类似物的作用时，GLP-1R/HEK293细胞内的cAMP含量会迅速升高，cAMP升高的水平与刺激物中GLP-1及其类似物的生物活性呈正相关。通过与GLP-1标准品生物活性的比较，测定未知样品中的GLP-1及其类似物的生物活性。

为构建能稳定表达GLP-1R的HEK293细胞株，本发明是通过以下技术方案来实现。

本发明的技术方案：一株GLP-1R/HEK293细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.5909，用胰高血糖素样肽-1受体，简写为GLP-1R，转染人胚肾HEK293细胞，获得的一株GLP-1R/HEK293细胞株。

所述GLP-1R/HEK293细胞株的应用，转染了GLP-1R基因条件下，在受体激动剂刺激下能诱导GLP-1R/HEK 293细胞胞内第二信使cAMP含量增加，转染的GLP-1R基因能够稳定表达；