[发明专利]油棕猝倒病菌的LAMP检测试剂及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及油棕猝倒病菌的检测技术，具体涉及油棕猝倒病菌的LAMP检测试剂及试剂盒。 

背景技术

油棕猝倒病是油棕上的一种重要病害，由华丽腐霉（Pythium splendens、油棕猝倒病菌）引起的，该病菌寄主范围很广，除侵染油棕（Elaeis guineensis）以外，还能够侵染玉米（Zea mays）、向日葵（Helianthus annuus）、大麦（Hordeum vulgare）、黄瓜（Cucumis sativus）、番薯（Ipomoea batatas）、小麦（Triticum aestivum）、蚕豆（Vicia faba）、豇豆（Vigna sinensis）、辣椒属（Capsicum spp.）、烟草（Nautilocalyx lynchei）、天竺葵属（Pelargonium spp.）、秋海棠属（Begonia spp.）等250余种植物，引起寄主幼苗整株失水萎蔫及根部、茎基部、切口变褐腐烂与皮层脱落等症状。目前油棕猝倒病菌的检测方法主要包括传统的形态学特征结合生理生化性状的生物学鉴定、核糖体DNA序列分析、特异性引物PCR和RFLP等。生物学鉴定方法耗工费时，而且某些形态特征不稳定，可能退化或消失，并且油棕猝倒病菌为异宗配合型，单性培养不能产生有性器官，更增加了其鉴定难度；核糖体DNA序列分析，虽然获得生物信息量大，但是实验操作繁琐，检测周期长；Wang等研制的特异性引物PCR灵敏度不是很高，无法检测较低含量的DNA样品； RFLP可省去序列分析中许多繁琐工序，但是需要进行多种酶切也费时费工，并且以上的分子检测方法都要进行电泳等PCR后处理，接触有毒试剂溴化乙锭，还易发生交叉污染而造成假阳性结果。环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）技术是日本学者Notomi在传统PCR技术基础上发展起来的一种新型体外核酸扩增方法，该技术依赖能够识别靶序列上6个特异区域的引物和链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在等温条件下高效、快捷、特异扩增靶序列。LAMP产物的检测一般采用琼脂糖凝胶电泳、浊度观察、荧光染料目测观察等方法。LAMP检测无需特殊的设备，并且不需EB等有毒试剂，操作简便且更安全。检测结果可以直接用肉眼观察，LAMP方法安全、快捷、高效、高灵敏度且无设备及技术限制，具有其他技术所无法替代的优势。目前，该技术已广泛应用于细菌或病毒的定性定量检测、临床疾病的诊断、动植物中致病微生物的检测等相关领域。对油棕猝倒病菌的检测未见报道。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供了应用环介导恒温扩增技术检测油棕猝倒病菌的试剂及试剂盒，可以实现对油棕猝倒病菌进行快速、安全、特异、灵敏、简便的现场检测，克服已有用 PCR 检测油棕猝倒病菌不能在生产中应用的问题。 

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为油棕猝倒病菌的LAMP检测试剂及试剂盒，主要包括三个部分： 

1、根据GenBank中已登录的P. splendensITS区序列，采用Blast程序进行同源性比较，在序列的保守区，使用PrimerExploer V4（http://primerexlorer.jp），设计提供 3 对用于检测油棕猝倒病菌的 LAMP 引物序列，依次命名为F3、B3、FIP、BIP、Loop1、Loop2，其核苷酸序列分别如下：

F3引物 5’-TGCAGATGTGAAGTGTCTCG-3’ ， 

B3引物 5’-ACAAACGGATTCCACACTCA-3’ ， 

FIP引物 5’-GCACCACACTTCACACAGACCATTTTCATGGTTGCGTTTTCGGAC-3’ ， 

BIP引物 5’-GGCTTTTGGCGACTTCGGCATTTTCGAAGCCTAACATACCGCG-3’ ， 

Loop1引物 5’-CCCTGTCCAT TTAAAAGGAC TCG-3’ ， 

Loop2引物 5’-TGAACATATG GAGACTACCT CGG-3’  。