[发明专利]硫化物醌氧化还原酶肠道定向表达载体及其细胞系

说明书

一、技术领域

   本发明涉及硫化物醌氧化还原酶肠道定向表达载体及其细胞系，属于生物技术领域。

二、背景技术

环境友好型养殖业是畜牧业可持续健康发展的新方向。改革开放以来，随着我国国民经济的全面、快速发展，人民生活需求水平的不断提高，我国畜牧产业规模化取得了空前的发展。然而，随着畜牧场规模化、集约化和机械化程度的提高，畜禽粪便已成为一个不可忽视的污染源。畜禽粪便不仅会带来水体和土壤污染，也会带来严重的空气污染。据检测，一个年出栏10万头的养猪场，每小时可向大气排出近148 kg氨气（NH3）、13.5 kg硫化氢（H2S）、24 kg粉尘和14亿个菌体，这些物质的污染半径可达5 km，而尘埃和病原微生物可随风传播30 km以上。如何降低这些废气排放一直是困扰大型养猪场的难题之一。目前，猪场对这些废气只能做到一定程度上的控制，不能做到真正无害化。主要采取的控制方法有吸附法、焚烧法、化学与生物除臭剂法、洗涤法及生物过滤等，这些方法对H2S、NH3等有害气体有一定的控制作用，但因成本较高或是二次污染问题而不能大规模运用。所以寻求一种经济可行的废气无害化处理方案很有必要。

硫化物-醌氧化还原酶，即Sul?de-Quinone Reductase或Sul?de:Quinone Oxidoreductase (SQR)，广泛存在于光营养和化学营养细菌（绿菌属、荚膜杆菌属、着色菌属等）中，它是一条57kDa的多肽，能够分解H₂S等硫化物。1997年，Shütz等从荚膜红杆菌中分离纯化出SQR，并将SQR基因成功克隆于大肠杆菌中，结果显示，大肠杆菌表达的SQR具有生物酶活性。另外很重要的一点是，SQR降解H₂S的反应是在细胞外进行的，无需进入细胞内。基于以上研究进展，利用SQR分解硫化物废气的生物学特性，综合现在的分子和细胞生物学手段，采用转基因手段在目的动物细胞中导入具有特殊生物学功能的外源SQR基因，通过转基因体细胞克隆技术途径获得能在肠道中稳定表达和稳定遗传的转SQR基因动物新品种，将可从源头上解决动物粪便中H₂S废气减排环境污染问题。

肠道脂肪酸结合蛋白（IFABP）是一类是重要的脂肪酸转运蛋白，其特异地表达于小肠上皮吸收细胞，与食物中长链脂肪酸(LCFA)的吸收、靶向运输及代谢密切相关。肠道脂肪酸结合蛋白启动子是IFABP特异表达于肠道的关键，相关研究显示IFABP启动子具有种间保守性，大鼠IFABP启动子能够启动人生长激素在小鼠肠道中特异表达。 所以本发明利用大鼠IFABP启动子构建SQR基因的肠道定向表达载体，并进一步转染体细胞，建立成纤维细胞系，解决了转基因动物肠道目的基因定向表达及其有效发挥其生物学功能的关键技术。

三、发明内容

技术问题  本发明的目的是提供SQR肠道定向表达载体pcDNA3.1-IFABP- SQR-GFP和pLenti4-IFABP- SQR-GFP慢病毒载体的构建方法及构建相关转基因细胞系的技术体系，是专用于生命科学和畜牧科研与生产的环保型的生物制品，可作为开展环境友好型转基因猪研究提供必要的生物材料及其相关关键技术方法参考。

技术方案  稳定表达SQR的真核细胞系，是通过以下方法生产的，包括：

（一）SQR肠道定向表达载体pcDNA3.1-IFABP- SQR-GFP的构建

1. SQR真核表达载体pcDNA3.1(-)-SQR-Myc构建

根据SQR基因序列，设计PCR引物P1，P2，为了加入Myc标签，P2引物3’端末端引入Myc-Tag序列。以原核载体pRSETA-SQR为模板进行PCR扩增，扩增产物（SQR-Myc基因片段）与pMD-18T使用T4 DNA连接酶连接，获得克隆载体pMD18T-SQR- Myc。

将pMD18T-SQR-Myc用限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ双酶切，纯化回收目的片段SQR-Myc，同时用相同内切酶酶切质粒pcDNA3.1(-)，将酶切回收后的pcDNA3.1(-)质粒片段和SQR-Myc目的片段由T4 DNA连接酶连接，获得真核表达载体pcDNA3.1(-)-SQR-Myc（图1）。

2. 中间载体pMD18T-SQR-GFP的构建