[发明专利]绿脓杆菌10118 PEA基因

说明书

技术领域

本发明涉及绿脓杆菌10118PEA基因。 

背景技术

绿脓杆菌为革兰氏阴性杆菌，在自然界中具广泛分布，绿脓杆菌是引起囊肿性纤维化、烧伤烫伤、免疫缺失等患者感染的主要病原菌，其合成的细胞外的毒性物质被认为是引起感染的内在机制，而绿脓杆菌外毒素A(ex-otoxinA，PEA)是这些毒物质中最关键的毒素。绿脓杆菌外毒素A是由假单胞菌属绿脓杆菌分泌的一种细胞毒性很强的外毒素，是重要的致病因子。PEA的ADP-核糖基转移酶活性能使靶细胞中的延长因子-2(EF-2)核糖基化，使EF-2失活，从而抑制细胞内蛋白质的合成，导致细胞的坏死。利用这种毒性作用制成针剂，对多种肿瘤细胞的免疫毒素进行肿瘤治疗的研究获得较好的效果。 

发明内容

本发明提供绿脓杆菌10118PEA基因，其编码的绿脓杆菌10118PEA蛋白具有很强的毒性，用于抑制肿瘤细胞内蛋白质的合成。 

本发明绿脓杆菌10118PEA基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。 

本发明绿脓杆菌10118PEA基因的5’UTR区域的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：2所示。 

本发明绿脓杆菌10118PEA基因编码蛋白绿脓杆菌10118外毒素A，对绿脓杆菌10118外毒素A进行毒力检测，与绿脓杆菌PA103外毒素A的毒力相近。说明绿脓杆菌10118PEA蛋白具有很强的毒性，利用这种毒性作用制成针剂，对多种肿瘤细胞的免疫毒素进行肿瘤治疗将获得较好的效果。 

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。 

具体实施方式一：本实施方式绿脓杆菌10118PEA基因的核苷酸序列如序列表中SEQID NO：1所示。 

绿脓杆菌10118PEA基因的获得方法如下： 

一、采用细菌基因组提取试剂盒(购买自北京康为世纪生物科技有限公司)提取铜绿假单胞菌10118(购买自中国医学细菌保藏管理中心)的基因组DNA；根据GenBank 数据库中已发表的绿脓杆菌PA103的序列(基因编号为：K01397)，设计上游引物P1和下游引物P2。 

二、以步骤一提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为25μL，由下列成分组成： 

PCR扩增条件为：94℃预变性3min，94℃变性20s，55℃退火30s，72℃延伸130s，共30个循环，再72℃延伸10min，4℃保存。 

PCR反应结束后对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒(购买自OMEGA公司)进行纯化回收，获得目的基因，该目的基因即为绿脓杆菌10118PEA基因。将该目的基因连接到pMD18-T载体(购自TaKaRa公司)上，得连接产物。 

将连接产物转化DH5α感受态细胞(购买自TaKaRa公司)，x-gal筛选阳性重组子，提取重组质粒委托上海美吉生物技术有限公司测序，测序结果表明绿脓杆菌PEA基因具有序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列，由1917个碱基组成。 

绿脓杆菌10118PEA蛋白的制备纯化及毒力检测： 

将绿脓杆菌10118接种于普通肉汤斜面培养基，37℃培养16-18h，用生理盐水制成浓度为1×10⁹个/mL的菌悬液，取1mL菌悬液接种于25mL种子培养基中，于250mL三角烧瓶中，于32℃、180r/min震荡培养6h，得；取1mL接种于50mL产毒培养基中，间隔采样测定pH和D_540nm，于32℃、180r/min震荡培养11.5-12h，pH升至8.4时终止培养，得培养物。