[发明专利]一种球虫卵囊培养保存液及应用方法

说明书

技术领域

本发明属于兽医寄生虫领域，涉及一种球虫卵囊培养保存液及应用方法。

背景技术

鸡球虫病(Coccidiosis)是一种由艾美耳属球虫寄生于鸡的肠道引起的具有重要经济意义的肠道寄生虫病，可降低增重和饲料报酬。本病分布很广，常呈地方流行性，给养鸡业带来很大威胁。长期以来，一直使用有效的药物来预防和治疗鸡球虫病，但这些药物的长期使用不可避免地导致了耐药虫株的产生，而且其在肉蛋内的残留也危及人类健康。而以鸡球虫病虫苗免疫为主的预防措施是控制球虫病的理想方法。与抗球虫药相比，应用鸡球虫病疫苗具有三大优势：一是无抗药性问题，预防鸡球虫病的效果更有保证；二是无药残和休药期问题，使用更安全；三是减少药费开支，降低养鸡生产成本。目前临床应用的鸡球虫疫苗都是不同配比的球虫孢子化活卵囊，其中上海市农业科学院畜牧兽医研究所研制的鸡球虫病疫苗2000年获得农业部颁发的新兽药证书。鸡球虫病疫苗的制备流程通常是先用不同的球虫种接种鸡，收集鸡粪和盲肠内容物中的新鲜球虫卵囊，培养成熟后配制球虫疫苗，保存待用。其关键除了作为核心的球虫虫种外，就是球虫卵囊的培养和保存。这是因为球虫卵囊的培养和保存在温度适宜的条件下，氧气对其正常发育和保持活力至关重要。因此，在球虫卵囊的培养过程中常常需要对培养液进行吹打或搅拌，以增加培养液的含氧量，同时为了防止微生物与球虫卵囊争夺有限的氧气，培养液常添加具有防腐消毒作用的物质来抑杀微生物，但又不能影响球虫卵囊正常的孢子化和活力。目前，球虫卵囊培养保存液最常用的是2.5％的重铬酸钾溶液(陈桂先，韦园园，陈汉忠，等.柔嫩艾美耳球虫广西南宁株的分离及鉴定[J].中国畜牧兽医，2010，37(9)：168-172.)。但重铬酸钾中的六价铬具有致癌性与细胞毒性，包括氧化应激、DNA损伤、细胞凋亡以及改变基因的表达(肖经纬.六价铬致DNA损伤机制的研究进展[J].国外医学卫生学分册，2006，33(2)：97-100.)。用重铬酸钾溶液作为球虫疫苗培养保存液，鸡接种后，六价铬就会排到环境中或在鸡体内沉积，进而导致环境污染和影响人类健康，因此研究开发可代替重铬酸钾的球虫卵囊培养保存剂对于保护环境、动物和人类的健康具有极其重要的意义。

为了解决使用重铬酸钾作为球虫卵囊培养保存剂可能带来的环境污染和动物健康等问题，各国科学家一直在试图寻找其替代品。捷克的A.Kitandu用1％氯胺B(w/v)作为保存剂(Kitandu A，JuranováR，I.Influence ofvaccination of hens with attenuated oocysts of Eimeria tenella，E.necatrix，E.acervulina and E.maxima on protection of offspring against Eimeria infection[J].ACTA VET.BRNO 2005，74：585-593.)，佛山正典生物技术有限公司的谭志坚等(谭志坚，翁亚彪.一种球虫卵囊培养液与保存液.中国专利，ZL200610034867.4[P].2008-02-06)发明了一种使用氯胺T溶液作为球虫卵囊培养液与保存液。氯胺是由次氯酸与胺、酰胺、亚胺或酰亚胺反应而产生。由于所用原料不同，而分为氯胺T、氯胺B与氯胺C。氯胺T化学名为甲苯磺酰氯胺钠盐，固体状态性质较稳定，但水溶液稳定性差。氯胺T是一种广谱杀菌剂，对细菌、病毒和真菌孢子都有较强的杀灭作用。其杀菌作用主要是由于氯胺T溶于水中产生次氯酸，放出活性氯。在水产养殖上常用于治疗细菌性疾病。由于次氯酸从氯胺释放的速度较慢，其杀菌效力较小，但作用时间较长。在碱性和大量有机物存在的环境中，杀菌作用减弱。因此，本品不能与碱和有机物混用，不能与任何裸露的金属容器接触，以防降低药效和产生药害(陈昌福.二氧化氯制剂是水产养殖用消毒剂的最佳选择(四)[J].渔业致富指南，2007，16：75-76.)。

发明内容

本发明的目的在于克服现有球虫卵囊培养保存液重铬酸钾溶液的安全性和潜在的环境污染及氯胺T溶液的性质不稳定等问题，获得一种安全高效、性质稳定的球虫卵囊培养保存液，并提供一种操作简便、宜于大规模应用的球虫卵囊培养方法。本发明对现有的数种安全的防腐消毒剂进行筛选，获得可作为球虫卵囊培养保存液的盐酸聚六亚甲基胍溶液。本发明还优化了盐酸聚六亚甲基胍溶液作为球虫卵囊培养保存液的浓度范围，并提供一种应用该培养保存液培养保存球虫卵囊的方法，大大简化了生产步骤，提高了工作效率。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：