[发明专利]一种多步衍生法同步分析碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物基样品的多步衍生法同步分析方法领域，具体涉及采用试管或滤纸片作为标本载体的多步衍生法同步分析生物基样品中碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物的方法。

背景技术

尿液含有碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类等许多内源性化合物的终末或中间代谢产物，这些小分子有机化合物大多数有相对较高的水溶性和肾廓清率，其浓度通常亦高于血清和其他组织体液，如血液、CSF(脑脊液)及组织液等，其中尿标本最易于收集，为非侵入性操作性技术，为国内外研究者所认同。二十世纪我国对遗传代谢性、营养性、线粒体性及药物性等代谢性疾病仅能进行初步检测，依赖欧日美等发达国家的检测技术且需将标本送至国外合作单位方可确诊；近十年来我国引进气相色谱-质谱联用(gas chromatography mass spectrometry，GC-MS)尿有机酸检测方法仅仅是检测有机酸类遗传代谢性疾病，而缺乏碱基、核苷、氨基酸及糖类等遗传代谢性疾病的筛查、监测和研究的样本预处理及同步分析方法，因而也严重影响我国各类代谢性疾病医学领域的整体研究水平。

首先，无论是色谱柱离子交换法还是有机酸萃取法，都只能分析尿中有机酸类物质，并且数量少，鲜有超过200种物质的文献报道；采用的是通过化学方法富集尿中有机酸，从而达到检测尿中有机酸的目的；现有的传统分析方法，无论是分析样本中酸性、碱性及中性有机酸类物质的数量，还是分析样本中物质的种类，和样本中客观存在的实际小分子的数量和种类相比，都存在严重不足，更缺乏碱基、核苷、氨基酸及糖类等物质的提取和同步分析的方法。

其次，脲素酶预处理法不经有机酸萃取直接进行GC-MS分析，用以鉴定有机酸和部分氨基酸及部分糖类代谢产物，虽然分析方法有很大的进展，但也易“漏检”酮类酸、醛类酸等有机酸，也对碱基、核苷、氨基酸及糖类等物质的全面同步分析的方法，仍显不足，不利于标本代谢物成分“高通量组学”全面分析；样本是在高温高压下进行的三甲基硅烷化衍生，部分物质易分解，从而再“漏检”芳香族氨基酸类、胺类、二肽类等物质。

再其次，处于代谢组学研究世界前沿水平的Fiehn数据库中的物质，主要是针对人体、细菌及植物的生理状态下和其遭受剧烈内外环境干扰下小分子代谢物成分“高通量组学”全面分析；分析方法取得更大的进展，但也“缺乏”碱基、核苷、有机酸、氨基酸及糖类等物质的“遗传性代谢病”全面同步分析的方法和数据，如苯丙酮尿症患儿尿液中独特的病理产物苯乙酸、苯乳酸、苯丙酮酸、邻羟基苯乙酸及扁桃酸；甲基丙二酸尿症患儿尿液中甲基柠檬酸等应用Fiehn数据库及其方法分析时就会“漏检”；因而临床应用仍显不足，不利于标本对500余种小儿遗传性代谢病“独特”代谢物成分“高通量组学”全面分析；

最后，面对分析生理、病理及遗传缺陷条件下的复杂样本客观需求，面对分析小分子物质数量巨大的难题和面对分析小分子物质种类众多且理化性质各异的难点等。开发样本预处理技术、建立代谢物标准数据库和样本分离及检测技术至关重要，也是制约该领域学科发展的瓶颈。而目前，气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)等仪器很好地解决了样本分离及检测技术难题，成为该应用技术领域的主流分析工具之一。也就是说，剩下的攻关技术主要是开发样本预处理技术及建立其代谢物标准数据库，提供一种同步分析碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物的方法，是目前研究的热点。

发明内容

针对现有色谱柱离子交换法、有机酸萃取法、脲素酶预处理法及Fiehn组学分析法等分析方法的缺陷，本发明的目的在于提供一种多步衍生法同步分析碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物的方法。该方法以生物基样本(尿液、血液、CSF(脑脊液)及组织液等)为检测对象，可以一次性多步衍生法同步分析上述多种物质的代谢中间和终末产物(包括酮类、醛类等物质)，可以利用多步衍生法同步分析人体、细菌及植物等生理、病理及遗传缺陷条件下的复杂样本中1000多种物质。

本发明的技术方案是：

一种多步衍生法同步分析碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物的方法(多步衍生法)，具体步骤包括：

1)取样：收集生物基样本；

2)定量待测样品：对生物基样本进行物理洗脱并收集洗脱液；测定洗脱液中肌酐含量，确定肌酐浓度，取相当于2.50μmoL/μL肌酐浓度的洗脱液25μL-300μL作为待测样品，备用；