[发明专利]一种烟草真空渗透直接遗传转化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物生物技术中植物转基因的技术，具体而言，涉及一种烟草真空渗透直接遗传转化的方法。

背景技术

植物细胞的遗传转化是植物遗传工程的一个关键环节。自Abel等(1986)将烟草花叶病毒(TMV)衣壳蛋白cDNA导入烟草细胞，获得抗TMV病毒的转基因烟草植株后，先后发展了许多植物遗传转化方法和技术。这些遗传转化方法和技术可以分为两大类，一是生物载体介导的遗传转化，另一类是非生物载体，即DNA直接导入的遗传转化。

生物载体介导的遗传转化主要是根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens，简称农杆菌)介导的遗传转化，De Cleene和De Ley(1976)报道，有138科，588属，1193种双子叶植物和裸子植物对农杆菌敏感。虽然曾有用DNA病毒(如花椰菜花叶病毒，CaMV)和RNA病毒(如烟草花叶病毒，TMV)为生物载体转化植物细胞，但因其宿主局限和转化植株发生病症的缺陷，已不再使用病毒为生物载体转化植物细胞。农杆菌介导的遗传转化法的优点是经济、且操作技术简单，容易在一般实验室中实施；缺点是对单子叶植物不敏感，并需要在筛选培养基中加入抑制农杆菌生长的抗生素，而这些抗生素对转基因细胞的分离和生长有影响。

在DNA直接导入的遗传转化中，又分为化学和物理的方法。化学方法有聚乙二醇(PEG)法(Golovkin等，1993)、脂质体法(Antonelli等，1990)、磷酸钙共沉淀法(Hain等，1985)、多聚阳离子二甲亚砜(The polycation DMSO)技术(Antonelli和Stadler，1989)和二乙基氨乙基葡聚糖(diethyl amino ethyl dextran，DEAE)方法。理论上，化学方法不受植物种类的限制，但由于化学方法使用的受体是原生质体，一般需要建立原生质体培养和再生体系，而许多植物的原生质体再生体系尚未建立，使这些方法的应用受到阻碍。虽然Naqvi等(2012)将芥菜(Brassica juncea)下胚轴浸入含有包裹pCAMBIA 1300质粒DNA的磷酸钙纳米粒子的缓冲液中，温育后筛选得到转基因植株，但制备纳米粒子的技术复杂。物理方法有微粒轰击法或基因枪法(Klein等，1987)、微量注射法(Crossway等，1986)、电击穿孔法(Fromm等，1985)、碳化硅纤维介导转化法(Kaeppler等，1992)、激光介导法(Guo等，1995)和花粉管通道法(周光宇，1978)。物理方法遗传转化的优点是不受植物种类的限制，缺点是大多数方法要求的设备昂贵，且操作技术不容易掌握；虽然其中也有不需要昂贵仪器、技术简单的方法，如电击穿孔法和花粉管通道法，但是电击穿孔法一般需要原生质体为受体，其应用也受到建立原生质体培养和再生体系的限制；花粉管通道法需要精确掌握受体的受精过程及其转化时间，迄今该方法仅仅在陆地棉遗传转化中获得成功。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服现有烟草(Nicotiana tabacum)遗传转化技术存在的不足，即在筛选培养转基因细胞过程中减少抑制农杆菌生长的措施，从而减少抑制农杆菌生长的抗生素对转基因细胞生长的影响；避免利用原生质体作为遗传转化的受体；减少所使用仪器的费用，使实验操作技术容易在普通实验室进行，而提出的一种烟草真空渗透直接遗传转化的方法。

本发明所提供的技术方案包括以下步骤：

(1)提取携带目的基因的重组pAHC25质粒

将含有重组pAHC25质粒的大肠杆菌JM109接种到含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃、转速为190rpm的摇床上过夜培养；碱裂法提取重组pAHC25质粒DNA后，将质粒DNA溶液的浓度调整为0.5～1.5μg/μl。酶切鉴定重组pAHC25质粒。

(2)预培养幼叶外植体

从高20cm左右的烟草盆栽苗上剪取幼叶，按常规方法进行表面消毒，将表面消毒的幼叶剪成0.3～0.5cm²的叶块，接种在MS1培养基(MS基本培养基中添加0.2mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.02mg/Lα-萘乙酸、3％蔗糖和0.65％琼脂；pH为5.6～5.8)上，在温度26+1℃、光照强度4000lx、光周期为16小时光照和8小时黑暗的条件下预培养3～8天。

(3)准备遗传转化使用的叶外植体