[发明专利]金银花4-香豆酸辅酶A连接酶（LJ4CL）基因及其编码产物和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，主要涉及利用全长cDNA文库克隆4-香豆酸辅酶A连接酶(LJ4CL)基因及其编码产物与应用，尤其涉及生物合成有药理活性成分的机酸类、黄酮类酶基因及其编码产物与应用，属于药用植物基因工程领域。 

背景技术

药用植物活性成分的形成是植物次生代谢途径中特有基因群的产物。随着植物功能基因组研究的广泛与深入，独具特色又有广阔应用前景的药用植物次生代谢合成相关功能基因的研究逐渐成为研究的热点，这些基因的克隆将为解析药用植物有效成分的生物合成途径及其调控机制和解释药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。 

药用植物的化学成分复杂，种类繁多，其中主要含有有机酸类、黄酮类、挥发油、萜类、二萜类、微量元素等多种成分。金银花Lonicera japonica Thunb为一味常用中药，主要用于身热、发疹、发斑、热毒疮痈、咽喉肿痛等症状的治疗，且具有较强的抗菌作用。金银花的主要活性成分包括绿原酸和木樨草苷等，其中绿原酸属于有机酸类，木犀草苷属于黄酮类化合物。 

4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate-CoA ligase，4CL)是植物天然苯丙基衍生物产物合成分歧途径中关键酶。4CL的主要功能是以肉桂酸及其羟基或甲氧基衍生物如4-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、5-羟基阿魏酸、芥子酸等为底物，生成相应的辅酶A酯。这些中间产物随后进人苯丙烷类衍生物支路合成途径，其中生成的香豆酞CoA、阿魏酞CoA及芥子酞CoA转化为肉桂醇衍生物，可以进一步转化为香豆素、绿原酸等，也可形成CoA酯，再进一步转化为木樨草苷、绿原酸等化合物。因此，4CL也是绿原酸和木樨草苷生物合成的关键酶。金银花4-香豆酸辅酶A连接酶(LJ4CL)基因的克隆，将为利用基因工程提高金银花活性成分含量提供重要基础。 

在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的金银花中苯丙氨酸解氨酶基因及其氨基酸序列。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种金银花4-香豆酸辅酶A连接酶(LJ4CL)基因。 

本发明第二个目的是提供该基因编码的蛋白质。 

本发明还提供了含有该基因的重组载体和宿主细胞。 

本发明的另一个目的在于提供该基因的应用。 

本发明所提供的金银花4-香豆酸辅酶A连接酶(LJ4CL)基因，为以下核苷酸序列之一： 

(1)具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列； 

(2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。 

该基因所编码的蛋白质为金银花4-香豆酸辅酶A连接酶(LJ4CL)基因，是以下氨基酸序列之一： 

(1)具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列； 

(2)SEQ ID NO.2添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。 

本发明所提供的金银花4-香豆酸辅酶A连接酶(LJ4CL)基因是首次从金银花中克隆制备的，体外实验表明，LJ4CL具有催化肉桂酸生成肉桂酸CoA的活性。利用本发明可以通过基因工程技术来提高金银花等植物中有机酸类物质绿原酸、黄酮类物质木犀草苷的含量。 

附图说明：

图1：LJ4CL功能域预测分析(来源于NCBI数据库)； 

图2：LJ4CL系统进化树(邻接法)； 

图3：植物表达载体pQE31-LJ4CL构建。 

具体实施方式

实施例1、金银花全长cDNA文库的构建 

1、金银花总RNA的分离和检测