[发明专利]鉴定鸡传染性支气管炎病毒流行株与疫苗株的RT-PCR法

权利要求书

1.鉴定鸡传染性支气管炎病毒流行株与疫苗株的引物组合，其特征在于，其包括：

上游引物P1：5’-GACCACAGTCACGCACAA-3’；

下游引物P2：5’-AATCTCCTCGGGTTCATC-3’；

下游引物P3：5’-AACTACACTCAACAATGGA-3’；以及

下游引物P4：5’-CCTGATTCTTCTTGATAC-3’。

2.含有权利要求1所述引物组合的用于鉴定鸡传染性支气管炎病毒流行株与疫苗株的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括随机引物、反应缓冲液、dNTPs、Rnase抑制剂、反转录酶、PCR Taq mix、DEPC处理水中的一种或多种。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性标准模板。

5.鉴定鸡传染性支气管炎病毒流行株与疫苗株的RT-PCR法，其特征在于，包括以下步骤：

1)样本总RNA的提取；

2)反转录得到样本cDNA；

3)以样本cDNA为模板，使用权利要求1的引物组合进行PCR扩增；

4)分析PCR扩增产物，结果判定。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3)中PCR反应体系以20μl计为：

PCR反应条件为：95℃ 5min；94℃ 45s，52.5℃ 45s，71℃ 60s，共30个循环；71℃ 10min。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)中反转录生成cDNA的方法为：

在0.2ml离心管内加入下列成分：

RNA溶液                        6μl

500μg/ml随机引物              1μl

混匀，70℃水浴5min，冰浴2min；

然后向上述离心管中加入下列成分：

混匀，将上述反应体系置于37℃ 1h，95℃ 5min，得到样本cDNA。