[发明专利]日本血吸虫SjEFCAB重组抗原蛋白、制备方法及用途

说明书

技术领域

本发明涉及分子、细胞生物学研究领域，具体涉及日本血吸虫含EF-hand结构域钙结合蛋白(SjEFCAB)的重组抗原蛋白及其制备方法。此外，本发明还涉及该日本血吸虫SjEFCAB重组抗原蛋白在制备检测日本血吸虫病患者血清抗体的产品中的应用。

背景技术

血吸虫病是一种严重危害人类健康并阻碍流行区社会经济发展的人兽共患寄生虫病。寄生于人和动物体内的血吸虫主要有3种，即曼氏血吸虫、日本血吸虫和埃及血吸虫，在我国仅有日本血吸虫病的流行，是卫生部规划防治的五大寄生虫病之一。至2009年，全国约有血吸虫病患者36.58万，病牛1.62万头，钉螺面积37.24亿平方米，受威胁人口3000万以上。

诊断是确定血吸虫感染率以及感染度的有效手段，为流行区的划分提供判断标准，并为血吸虫病防治活动的各个环节提供必不可少的信息和科学依据，在防治工作中处于重要位置。无论从个体水平确定药物化疗的对象、考核化疗的效果，还是在群体水平监测血吸虫病疫情的变化、考核血吸虫病控制效果和评估流行趋势等等，均需要以诊断结果作为评判依据之一。

传统的病原学方法是诊断血吸虫病最为经典和可靠的途径，但费时、费力，且敏感性不高，流行区人群的依从性呈逐年下降趋势。由于免疫学的诊断方法具有操作简便、敏感性和特异性较好的优点，近年来发展迅速。

免疫诊断中最常用的抗原是成虫和虫卵抗原，但抗原成分复杂易产生交叉反应，来源有限且不易质控，难以适应大规模现场疾病普查的需求。随着分子生物学、免疫学和蛋白质组学的不断发展，成分明确、特异性好的重组抗原逐渐成为血吸虫病诊断抗原研究的一个重要方向。

钙是真核生物体内一种重要的第二信使，在细胞信号转导途径中发挥重要的作用，很多生理活动的控制调节都由钙来完成，例如腺体分泌、肌肉收缩、转录调控、细胞分裂等。因此，组织中钙离子的浓度必须在系统和细胞水平得到精细的调节，这项功能则由种类繁多的钙结合蛋白来完成。

钙结合蛋白包括EF-hand家族蛋白和非EF-hand家族蛋白。EF-hand结构域是一种具有钙结合位点的螺旋-中央环-螺旋的结构，其中E、F两段螺旋几乎是垂直的，这有利于它们结合钙离子。常见的含有EF-hand结构域的蛋白按照功能可以分为调节型蛋白和结构组成型蛋白两类，前者在结合钙离子之后产生构象的变化，并且有酶活性的改变；后者结合钙离子后并没有产生类似的变化，它们似乎仅是起到胞内钙离子水平的缓存作用。

Moser等克隆了在曼氏血吸虫虫卵阶段表达的钙结合蛋白SmE16基因，利用表达载体pEx34b，在大肠杆菌中以MS2融合蛋白的形式表达(MS2-SmE16)；该蛋白含有4个EF-hand基序，Mr为16000，与钙调蛋白和肌原蛋白C同源，属于钙结合蛋白家族，并被证明是血清学诊断的一种优势抗原。用MS2-SmE16诊断血吸虫病的敏感性为87％，且具有较好的特异性。王兆军等克隆和表达了日本血吸虫钙结合蛋白SjE16基因，该重组蛋白用于日本血吸虫病兔抗体ELISA检测，特异性和敏感性分别为94.1％和88.2％，并可以反映动物感染和治疗情况；检测血吸虫病患者血清抗体的特异性为98.3％，检测急性和慢性血吸虫病患者的敏感性分别为85.5％和70.2％；上述研究表明SjE16重组蛋白具有诊断现症感染和疗效考核的潜能。

日本血吸虫含EF-hand结构域的钙结合蛋白(SjEFCAB)的相对分子量(Mr)约为8200，等电点为4.78，定位于细胞核，预测其二级结构中含有较多的α螺旋区(Alpha helix，60.56％)、无规则卷曲(Random coil，29.58％)和少量的β转角(Beta turn，9.86％)。生物信息学分析结果同时表明SjEFCAB蛋白含有两个EF-hand结构域，分别位于第7-35位、第44-71位氨基酸残基之间，无信号肽和跨膜结构。

在本发明之前，还没有出现涉及本发明日本血吸虫SjEFCAB重组抗原蛋白及其用于日本血吸虫病诊断的公开报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一对用于日本血吸虫SjEFCAB基因PCR扩增的特异性引物。

本发明要解决的技术问题之二是提供一种日本血吸虫SjEFCAB重组抗原蛋白的制备方法。

本发明要解决的技术问题之三是提供采用上述方法制得的日本血吸虫SjEFCAB重组抗原蛋白。

本发明要解决的技术问题之四是提供该日本血吸虫SjEFCAB重组抗原蛋白在制备检测日本血吸虫病患者血清抗体的产品中的应用。