[发明专利]一种乙型肝炎疫苗及其制备工艺

说明书

分案申请

本申请是根据PCT申请号PCT/KR2008/000518，国际申请日2008.01.28，优先权日2007.01.31，进入国家阶段日期2009.07.20，申请号200880002629.2，发明名称为“一种乙型肝炎疫苗及其制备工艺”提出的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种抗乙型肝炎病毒(HBV)的乙型肝炎疫苗，其包括完全的HBV表面抗原，该表面抗原由preS抗原和S抗原组成，一种复合HBV抗原疫苗，该复合HBV抗原疫苗除该完全的表面抗原外还进一步包括一种HBV核心抗原，及其制备方法。

背景技术

HBV感染导致急性和慢性肝炎。大部分HBV感染者在一到两个月后能够从病毒感染中完全康复，但是有约10％的HBV感染者会成为慢性肝炎患者。根据感染年龄的不同，转为慢性感染的比例随感染年龄的增大而显著下降，两个月以下的新生儿超过95％，五岁的儿童则为25％。HBV慢性感染导致罹患肝硬化和肝癌的风险上升。HBV表面抗原(HBsAg)可从HBV慢性感染患者的血液中检出，但是抗HBsAg抗体并不一定随免疫耐受性的发展而获得。因此，治愈HBV慢性感染的最终目的是在血清中诱发抗HBsAg抗体，并将HBV从血液和肝脏中去除。

本发明揭露的治疗疫苗适用于HBV慢性感染的治疗，因为其破坏了免疫耐受性并诱发对HBV的免疫应答，从而从血液中去除HBV抗原。针对HBV慢性感染的治疗疫苗应当满足下列条件：必须能够破坏免疫耐受性并诱发对HBV的免疫应答，引起强的体液和细胞介导免疫力以消除慢性病毒感染。

在感染了HBV后，当多克隆免疫应答被诱发时，感染可以被消除。但是，当弱寡克隆免疫应答被诱发时，感染会演变成慢性感染。这一发现指出治疗疫苗必须含有能提供诱发多克隆免疫应答所需的多种表位的抗原。

HBV的包膜抗原基因由preS(preS1和preS2)区及S区组成。在转录后，通过对三种起始密码子各自进行交替翻译，合成三种包膜蛋白(L蛋白，M蛋白和S蛋白)。L蛋白由约400个氨基酸组成，视HBV亚型不同，包括preS1域，preS2域及S域，翻译起始从其中的preS1 AUG密码子开始。M蛋白由约281个氨基酸组成，包括preS2域及S域，翻译起始从其中的preS2开始。S蛋白由约226个氨基酸组成，仅包括S域，并组成病毒粒子中最丰富的部分。这些包膜蛋白的S域被植入类脂膜，并根据三种不同大小的包膜蛋白的比例，组成22nm到42nm的粒子和棒状形态。M蛋白和L蛋白含有的preS1域和preS2域高度免疫原并有助于在单独S蛋白不能免疫原的特定同类系小鼠身上诱发S蛋白特异性抗体。

如上所述，有鉴于整套的包膜抗原特定表位和作为高免疫原粒子形态的HBV抗原非常重要，因此本发明的目的在于开发一种含有完整的preS蛋白和S蛋白的乙型肝炎疫苗。具体地，动物实验和人体实验都表明含有preS抗原和S抗原的疫苗比只含有S抗原的疫苗能够诱发更强的免疫应答和远为快速的响应。也就是说，与只含有S抗原的疫苗相比，同时含有preS抗原和S抗原的疫苗更免疫原并诱发快速的免疫应答，从而表明L蛋白可用于作为治疗慢性乙型肝炎感染的治疗疫苗。

但是，市售的大多数乙型肝炎疫苗只含有S蛋白。这可归结于见于慢性HBV患者的粒子形态的L蛋白仍未成功从真核细胞表达系统如啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)或多形汉森酵母菌(Hansenulapolymorpha)表达。

进一步的，曾有人尝试将preS抗原(具体地，preS2)的一部分和S抗原在真核细胞如啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)或多形汉森酵母菌(Hansenula polymorpha)中联合表达，但是，得到的产品并未发现有足够的免疫原性。

此外，也曾有人尝试生产将preS基因单独表达以制成单独的preS抗原，然后与S抗原混合而得的HBV抗原。但是，得到的preS抗原的线性可溶形态并不十分免疫原。因此，与preS抗原和S抗原以粒子形态被联合表达，且preS抗原位于粒子的外表面的完全表面抗原相比较，改进免疫原性的尝试并不成功。

综上所述，为改进免疫原性，preS抗原和S抗原必须被同时表达，且preS抗原必须位于由S抗原组成的粒子的外表面。近来，赛真(Scigen)在以色列开发出一种乙型肝炎疫苗，并且他们声称含有完全表面抗原即preS抗原和S抗原。

发明内容

技术难点