[发明专利]一种藻类RNA提取剂及使用方法

权利要求书

1. 一种藻类RNA提取剂，其特征在于，所述藻类RNA提取剂由Tris-HCl、NaCl、EDTA、CTAB、DTT、和柠檬酸钠溶于DEPC水溶液中而成；其中，Tris-HCl的终浓度为0.05-0.2 mol/L，NaCl的终浓度为1.5-2.5 mol/L，EDTA的终浓度为0.03-0.06 mol/L，CTAB的终浓度为0.05-0.15 mmol/L，柠檬酸钠的终浓度为25-30 mmol/L，藻类RNA提取剂的终浓度为30-80 mmol/L。

2.根据权利要求1所述的一种藻类RNA提取剂，其特征在于，所述DEPC水溶液的质量分数为0.1%-0.2%。

3.一种权利要求1所述的藻类RNA提取剂应用于提取藻类RNA的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括以下步骤：

步骤a）处理样品：将新鲜或超低温冷冻的藻类，用纯净水冲洗干净，然后沥干；取沥干后的藻类0.1-0.5g，在液氮中研磨至粉末状；

步骤b）配制提取剂：向Tris-HCl、NaCl、EDTA、CTAB与柠檬酸钠中加入质量分数为0.1-0.2%的DEPC水溶液，然后在室温下静置过夜，在121℃灭菌15-20min，得到提取剂半成品；向提取剂半成品中加入2-4mol/L 的DTT至终浓度30-80m mol/L，得到提取剂;其中Tris-HCl的终浓度为0.05-0.2 mol/L，NaCl的终浓度为1.5-2.5 mol/L，EDTA的终浓度为0.03-0.06 mol/L，CTAB的终浓度为0.05-0.15 mmol/L，柠檬酸钠的终浓度为25-30 mmol/L；

步骤c）抽提：将步骤a）的粉末状样品倒入盛有2-4mL提取剂的离心管中，涡旋混匀2-4min，将离心管在室温下放置15-30min，期间每隔5min摇晃离心管一次；然后向离心管中加入2-4mL的氯仿与异戊醇的混合液，涡旋混匀2-4min，然后于0-4℃，离心力10000-15000g的条件下离心15-30min；吸取上清液于另一干净离心管内，加入上清液体积20%-40%的无水乙醇，涡旋混匀2-4min；然后向加入了无水乙醇的上清液中加入2-4mL的氯仿与异戊醇的混合液，涡旋混匀2-4min，于0-4℃，离心力10000-15000g的条件下离心15-30min；

步骤d）：吸取步骤c）抽提后的上清液于干净离心管内，加入上清液体积20%-40%的12 mol/L LiCl溶液并涡旋混匀2-4min，-50—-80℃条件下静置30-60min，得到粗样品；

步骤e）沉淀：将步骤d）静置后的粗样品于0-4℃，离心力12500-15000g的条件下，离心20-40 min；弃上清液，取出沉淀，用0.5-2mL的体积分数70%-75%的乙醇溶液清洗沉淀，之后于0-4 ℃下，离心力12000g，离心10 min；

步骤f）：将步骤e）中的上清液于于0-4℃，离心力12500-15000g的条件下，离心20-40 min，取出沉淀，用0.5-2mL体积分数70%-75%的乙醇溶液清洗沉淀，之后于0-4 ℃下，离心力12000g，离心10 min将该次离心得到的沉淀与步骤e）得到的沉淀合并得到粗沉淀；

步骤g）：将步骤f）处理后的粗沉淀在10-30℃下风干，然后用20-50μL的质量分数0.1%-0.2%的DEPC水溶液溶解风干后的沉淀，用RNase-Free DNase set（50）试剂盒去除样品总RNA中DNA；

    步骤h）：将步骤g）去除DNA后的样品总RNA移入干净离心管，加入与样品总RNA等体积的氯仿与异戊醇混合液进行抽提，0-4 ℃，离心力12000g的条件下离心10 -25min；取上清液，移入新离心管内，加入上清液体积10%-15%的3-5 mol/L的醋酸钠溶液，调节溶液的pH4-5，然后加入2-3倍上清液体积的无水乙醇，在-70℃冰浴沉淀45-60min；然后在0-4 ℃，离心力12,000g的条件下离心10 min，弃上清液，沉淀即为纯化的藻类RNA。

4.根据权利要求3所述的一种藻类RNA应用于藻类RNA提取的使用方法，其特征在于，所述步骤c）与步骤h）中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。

5.根据权利要求3或4所述的一种藻类RNA应用于藻类RNA提取的使用方法，其特征在于，所述步骤a）中所用藻类为红藻、绿藻或褐藻。