[发明专利]一种基于表面等离子共振技术的塑料玩具中有害化合物检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种塑料玩具中有害化合物检测技术。特别是基于表面等离子体共振技术，通过核酸适配体与未标记、标记样品进行特异性竞争识别，采用凝血酶适配体修饰的传感元件间接检测塑料玩具中有害化合物的方法。

背景技术

玩具一直是婴幼儿的亲密伙伴，但是也会带来健康问题，有害化合物残留就是潜藏在塑料玩具中的隐形杀手。婴儿玩具中涉及有害化学物质的种类繁多，如树脂及稳定剂、增塑剂、着色剂等添加剂等。近年来出现的双酚A事件引起了人们对塑料玩具中有害化学物质的广泛关注，双酚A是制造环氧树脂、聚碳酸树脂、聚苯乙烯树脂的主要原料，又是用于酚醛树脂、聚氯乙烯、抗氧化剂等的稳定剂。在婴儿玩耍过程中，误舔误食均有可能引起双酚A从玩具中迁移出来，而直接进入体内，对婴儿发育、免疫力造成影响，甚至致癌。2011年，欧盟颁布了“新玩具安全指令”，明确规定在欧盟市场销售的玩具必须符合新指令及适用标准，表明欧盟相关贸易壁垒再次升级。因此，塑料玩具中的有害化合物残留越来越引起了国内外的普遍重视。

传统检测有害化合物残留的方法主要有液相色谱、气相色谱、气液质联用仪等。这些方法虽然具有灵敏度高、使用范围广等优点，但价格昂贵、处理复杂、实验过程繁琐费时，所用大量的有机试剂易污染环境，不能进行在线检测。目前，免疫分析技术是有害化合物快速检测中应用最普遍的技术。然而，现有免疫检测技术所用试剂盒和传感器往往具有专一性；免疫标记物也存在不稳定、容易失活等缺点，限制了相关免疫分析技术的进一步发展。

表面等离子体共振技术因其具有高灵敏度、操作简单、响应快、无须标记与耗样量少等优点，已广泛用于生化检测领域。该技术不仅可以检测分析物，而且可以测定分子间相互作用的动力学常数，可以为塑料玩具中有害化合物快速检测提供一种简便可靠的方法；但与酶联免疫吸附法、生物传感器检测法以及荧光分析法相比，仍然存在传感芯片检测专一性和成本高问题。例如，采用表面等离子体共振原理检测的仪器BIACore，其常用传感器芯片SA芯片成本为3000多元人民币。因此，如何实现同一传感芯片检测不同有害化合物已成为表面等离子体共振检测领域热点研究问题。

发明内容

为了解决现有有害化合物免疫分析技术存在的传感专一性、抗体稳定性差、耗材量大、造价昂贵等问题，同时极大提高有害化合物的检测限，本发明提供了一种基于表面等离子体共振仪检测塑料玩具中有害化合物的检测方法。该方法具有通用、高稳定性、高灵敏度、操作简单等优点，满足对玩具中各种有害化合物的检测要求。

本发明的技术方案为：一种应用表面等离子体共振仪的塑料玩具中有害化合物检测方法，利用同一传感芯片对不同有害化合物的含量进行检测；其特征在于包括以下步骤：

（一）传感芯片表面适配体固定：选择链霉亲和素SA修饰的传感芯片，通过通入5-50μL浓度为1-50μg/L已标记生物素的凝血酶适配体，在表面等离子体传感芯片上固定上凝血酶适配体；

（二）对待测有害化合物进行凝血酶标记，标记方法根据待测物基团不同，选择EDC/NHS法交联羧基与氨基或戊二醛法交联两个氨基；

（三）标准溶液配制：用0.01-0.1mol/L（pH＝7.4）的磷酸盐缓冲液配置有害化合物的标准样品储备液，储备液浓度为0.1ng/mL至1mg/mL，用磷酸盐缓冲液将储备液配制成不同浓度的标准溶液，取不同浓度未标记待测有害化合物的标准溶液和凝血酶标记的待测有害化合物分充分混合后，竞争结合有害化合物相应的适配体或纳米粒子修饰的适配体，其中凝血酶标记的有害化合物应不少于加入的适配体量；

（四）建立标准曲线：采用表面等离子共振谱仪测量，以0.02mol/L的磷酸盐缓冲液为测量基准，通过微泵通入5-100μL待测混合样品，记录下表面等离子体共振仪光谱图，通过检测凝血酶的含量，间接检测有害化合物；取不同浓度待测样品的表面等离子体共振谱图稳定值，绘制工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得回归标准曲线；

（五）定量检测：对于未知含量的有害化合物进行检测，同样按照步骤（三）进行；采用表面等离子体共振检测仪记录有害化合物的光谱图；将光谱图中残留组分的稳定值代入相应的回归曲线方程，计算出塑料玩具中有害化合物的浓度值；

（六）通入0.01-0.05mol/L（pH为2-3）的甘氨酸-盐酸缓冲溶液，冲洗传感芯片表面，进行传感元件再生，用于其它有害化合物检测。

所述标记方法包括EDC/NHS法或戊二醛法。

可以采用核酸适配体为识别分子，核酸适配体序列与待测物直接相关。