[发明专利]动物α干扰素和γ干扰素的表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种干扰素的表达方法，尤其涉及一种在昆虫杆状病毒生物反应器中联合表达或共表达动物α干扰素和γ干扰素的方法，属于重组干扰素的制备领域。

背景技术

干扰素(Interferon，IFN)是在特定的诱生剂的作用下，由细胞产生的一种具有高度生物活性的糖蛋白，在本动物细胞中具有广谱抗病毒活性。目前已知干扰素并非直接杀伤病毒，而是通过诱导宿主本身的细胞产生多种酶来干扰病毒的基因转录或者病毒蛋白组分的翻译。干扰素根据产生的细胞来源不同、理化性质和生物学活性差异等方面可以分为I型和II型IFN；I型IFN主要包括IFN-α、β、ω、δ、κ、ε、ζ和τ等，II型IFN只有IFN-γ一种(Cann AJ.Principles ofMolecular Virology.Beijing：Science Press，2006：177-178)。IFN-γ主要是由机体内活化的T淋巴细胞和NK细胞产生的，当抗原、PHA或者ConA刺激后T细胞分泌产生IFN-γ，通常与IL-2的产生一致，IFN-γ对酸敏感，具有抑制病毒复制调节作用，但其抗病毒作用比I型干扰素弱，主要参与诱导主要组织相容性抗原(MHC)的表达盒免疫调节效应，也称为免疫干扰素。I型干扰素的抗病毒活性较II型干扰素要高，但由于II型干扰素具有诱导调节作用，所以对某种生物体(如猪、狗、鸡等)用两种类型干扰素的混合剂的效价远远高于单一任意一种干扰素的效用。

干扰素自1957年有Isaacs等人发现后，就一直被克隆并在各种生物反应器中进行表达，比如Vandenbroeck等在大肠杆菌中和昆虫细胞中对猪PoIFN-γ基因的外显子进行了克隆和拼接表达(Vandenbroeck K，et al.Biochem Biophys Res Commun，1991：1408-1415；Vandenbroeck K，et al.Lymphokine Cytokine Res，1994：253-258)，同样国内一些研究者也先后利用不同的表达系统表达了PoIFN-γ。

人IgG免疫球蛋白在人体内的半衰期可达到19～21天，IgG的Fc片段被用来与IFN2α连接构成融合蛋白，Fc片段使融合蛋白分子量增大，避免被肾小球滤过，同时Fc片段可与新生Fc受体结合，避免融合蛋白进入溶酶体中被降解，从而延长体内半衰期。构建了IFN2α2b与人IgG免疫球蛋白Fc片段的融合基因并在毕赤酵母中以二聚体形式分泌表达，并有部分糖基化。大鼠皮下注射后循环血液中半衰期达65h，血液中存留时间120h以上，比普通重组干扰素的体内半衰期延长约8倍，血液存留时间延长10倍，显示了其良好的临床应用前景(王磊，生物工程学报，2008：53-62)。

同样的原理，猪、鸡、犬的α或γ的长效干扰素也可以用相应动物的IgG的Fc片段或HAS序列与其α或γ干扰素基因进行融合表达，应用本申请的方法可获得相应的长效干扰素。

杆状病毒表达系统这一生物反应器是八十年代建立起来的。自从1983年首次利用杆状病毒表达系统高效表达了人的α-干扰素以来(Smith，Mol.Cell Biol.，3：2156-2165，1983)，已有数十个外源基因得到了高效表达。昆虫杆状病毒表达载体系统是当今基因工程四大表达系统之一，相对于原核表达系统而言，杆状病毒表达系统是一种真核表达系统，具有真核蛋白翻译后加工、修饰和转运体系，表达产物在生物活性、抗原性和免疫原性方面接近天然产物。利用此系统来生产重组蛋白包括各种干扰素的优点在于：1.这一表达系统的表达效率极高，产量可达毫克级/虫的水平，因而可大大降低生产成本并使许多贵重的重组蛋白的大规模生产成为可能；2.这一表达系统为真核表达系统，其表达的外源蛋白质可进行翻译后修饰，使其在生化性质和生物活性等与天然产品相似，这为表达出的重组蛋白具有正常的生物学活性提供了保证。目前，杆状病毒表达系统，尤其是其中的家蚕(Bm)-家蚕杆状病毒(BmNPV)表达系统是世界上最具有商业开发价值的真核生物个体表达系统之一。已经成为当今基因工程常用的四大表达系统(即杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统)之一。