[发明专利]检测维生素C生产菌株传代培养过程中营养环境变化的方法

说明书

技术领域

本发明属于工业微生物领域，涉及一种检测维生素C生产菌株传代过程中营养环境变化的方法。

背景技术

目前，我国生产维生素C的方法为“二步发酵法”，第一步发酵使用黑醋杆菌将山梨醇转化为L-山梨糖，第二步发酵为巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌混合发酵，将山梨糖转化为维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸。其中，第二步发酵中前者为伴生菌，后者为产酸菌。两菌在混合发酵的过程中，通过相互作用促进产酸菌的生长和产酸。通过混菌传代培养，混菌发酵生产2-酮基-L-古龙酸的能力得到提高，但其作用机理尚不明确。

随着高通量的现代仪器分析技术和化学计量学方法的发展，过程分析技术(PAT)可以有效地应用于生物发酵过程中营养环境变化的研究。在两菌长期的混合培养中，它们之间的交流使得培养液的营养环境不断的发生变化，进而传递到胞内，产生一系列不同的生长及发酵行为。

如果采用PAT技术研究两菌传代培养，特别是在不断强化相互作用的过程中，检测出培养基中营养环境的变化情况，将为揭示传代培养强化两菌相互作用促进产酸的作用机制提供有利信息，并为进一步优化生产工艺等提供支持。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种检测维生素C生产菌株传代过程中营养环境变化的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种检测维生素C生产菌株传代过程中营养环境变化的方法，包括如下步骤：

(1)混菌传代培养：

①固体培养：

取存于液氮的10-500μL保藏于体积浓度为15-30％的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和10-500μL保藏于体积浓度为15-30％的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上，28-35℃，培养24-48h；

②种子培养：

将经步骤(1)①培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡培养24-48h，分别得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；

将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到一个新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁷-2×10¹⁰CFU/mL，使氧化葡糖杆菌的密度为2×10⁸-2×10¹¹CFU/mL，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡混菌培养，以24-48h为传代周期，以体积比为1％-10％为传代比接入新的种子培养基中，传代100-150天得到混菌细胞，在传代0-100天或0-150天中选定3-4个时间取样，取3-4个样；

③分纯：

将步骤(1)②获得的3-4个样的混菌细胞划线分纯后再分别接种于固体培养基上，28-35℃培养24-48h；再分别转入新的种子培养基，在28-35℃，200-280rpm摇床振荡培养24-48h，分别得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；保藏于体积浓度为15-30％的甘油水溶液中；

④发酵：

将步骤(1)③获得的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌以及将两种菌混合在一起的混合菌，分别接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁷-2×10¹⁰CFU/mL，氧化葡糖杆菌的密度为2×10⁸-2×10¹¹CFU/mL，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡培养10-15h；

(2)营养环境中物质的测定：

①培养液的收集：

分别取步骤(1)④获得的巨大芽孢杆菌培养液、氧化葡糖杆菌培养液和混菌体系培养液1-2mL，以5000-10000rpm的转速离心，收集上清，并用0.22μm纤维素微孔滤膜过滤，得滤液；

②样品制备：

取步骤(2)①获得的滤液10-50μL置于离心管中，加入50-200μL的0.04-0.14mg/ml氘标记的琥珀酸甲醇溶液为内标物，冷冻干燥；加入40-100μL浓度为20mg/mL的甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶液于30℃-40℃水浴中肟化反应60-120min；再加入50-100μLN-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺于35℃-40℃水浴进行硅烷化反应30-60min；

③GC-TOFMS检测：