[发明专利]一种针对整合酶核心区去整合反应的整合酶抑制剂体外筛选方法

权利要求书

1.一种针对整合酶核心区去整合反应的HIV-1整合酶抑制剂体外筛选方法，包括以下步骤：

(1)整合酶核心区蛋白的制备：

表达纯化野生型整合酶核心区蛋白，定量后稀释为3600nmol/L，分装保存待用。

(2)去整合DNA底物的制备：

将合成的寡核苷酸链1、2、3、4分别按照等摩尔浓度比例混合，震荡混匀后用铝箔纸完全封闭避光，置于95℃下孵育5分钟变性，缓慢冷却至室温退火，稀释为750nmol/L，分装避光保存待用；所述寡核苷酸序列如下：

寡核苷酸链1：5’-CCTCGAAGTCGACCTGCAGCCCAAGCTTGCGTTGCTGAACGAGG-3’

寡核苷酸链2：5’-ATGTGGAAAATCTCTAGCAGGCTGCAGGTCGAC-3’

寡核苷酸链3：5’-ACTGCTAGAGGATTTTCCACAT-3’

寡核苷酸链4：5’-CAGCAACGCAAGCTTG-3’；

(3)待测化合物样品的制备：

室温下将待测化合物样品用二甲亚砜配制成不同浓度的溶液，充分振荡溶解后备用；

(4)待测化合物样品的筛选：

反应体系为50μl/微孔，加入去离子水40μl。微孔板设阴性对照3孔，每孔分别加入2μl二甲亚砜，其他孔中每孔分别加入2μl不同浓度的待测化合物样品，设阳性对照3孔，加入的5μl蛋白质样品为高温变性后的整合酶核心区蛋白，之后所有孔均分别加入5μl整合酶核心区蛋白，振荡器充分混匀后，在25℃下孵育10～30分钟，加入去整合DNA底物3μl，振荡器充分混匀后，在37℃下孵育30分钟，用荧光分析仪检测报告基团信号，

按照以下公式计算待测样品的抑制率：

计算待测样品的抑制率。

2.根据权利要求1所述一种针对整合酶核心区去整合反应的HIV-1整合酶抑制剂体外筛选方法，其特征在于：所述DNA底物为使用了由荧光基团和淬灭基团标记的DNA底物，DNA底物由寡核苷酸链寡核苷酸链1、2、3、4混合、变性、退火后制备而成，寡核苷酸链序列为：

1：5’-CCTCGAAGTCGACCTGCAGCCCAAGCTTGCGTTGCTGAACGAGG-3’中5’端标记5-羧基荧光素，3’端标记4-(4’-二甲基对氨基偶氮苯)苯甲酸；

2：5’-ATGTGGAAAATCTCTAGCAGGCTGCAGGTCGAC-3’；

3：5’-ACTGCTAGAGGATTTTCCACAT-3’；

4：5’-CAGCAACGCAAGCTTG-3’。

3.根据权利要求1所述一种针对整合酶核心区去整合反应的HIV-1整合酶抑制剂体外筛选方法，其特征在于：所述整合酶核心区蛋白的制备，采用基于磁珠吸附DNA技术结合ELISA的液相微孔板方法中所用的制备方法。