[发明专利]肝实质细胞及其制备、鉴定与应用方法

权利要求书

1.制备肝实质细胞的方法，包括如下步骤：

1)将多潜能干细胞培养获得内胚层细胞；

2)将获自步骤1)的内胚层细胞转入到原始肠管诱导培养基中进行培养，获得原始肠管细胞；

3)将获自步骤2)的细胞进行传代，并转入到在含有成纤维细胞生长因子-7，骨成型蛋白-2和骨成型蛋白-4的肝细胞诱导培养基I中培养，检测所获得的细胞的PROX1和HNF6的表达，获得表达PROX1和HNF6的成肝细胞；

4)将获自步骤3)的成肝细胞培养获得成熟的肝实质细胞，

其中所述多潜能干细胞为诱导多能性干细胞，即iPS细胞，或下述任一种NIH编号的细胞系的细胞：BG01,BG02,BG03,BG04，SA01,SA02,SA03，ES01,ES02,ES03,ES04,ES05,ES06，TE03,TE32,TE33,TE04,TE06,TE62,TE07,TE72，UC01,UC06，WA01,WA07,WA09,WA13和WA14。

2.权利要求1所述的方法，其中所述步骤2)包括：将获自步骤1)的细胞转入到含有成纤维细胞生长因子(FGF)和转化生长因子(TGF-b)信号通路的小分子抑制剂的原始肠管诱导培养基中进行培养，从而获得原始肠管细胞。

3.权利要求1或2所述的方法，其中所述原始肠管诱导培养基包含成纤维细胞生长因子-7和转化生长因子信号通路的小分子抑制剂SB431542。

4.权利要求1或2所述的方法，其中所述多潜能干细胞为诱导形成的多潜能干细胞。

5.权利要求1所述的方法，其中产生共表达HNF4A和PROX1的成肝细胞的效率大于60％。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述多潜能干细胞为哺乳动物细胞。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述多潜能干细胞为小鼠或人细胞。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述多潜能干细胞为人细胞。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法获得的肝实质细胞。

10.权利要求9所述的肝实质细胞，所述细胞分泌白蛋白，所分泌的白蛋白水平达到人原代成体肝实质细胞分泌白蛋白的水平。

11.权利要求10所述的肝实质细胞，所述细胞还具有选自储存糖原、产生细胞色素P450酶，进行一相、二相代谢，三相转运中的一项或多项功能。

12.权利要求9-11中任一项所述的肝实质细胞在药物代谢研究、药物的毒性测试或药物筛选中的应用。

13.鉴定具有代谢功能的肝实质细胞的方法，其特征在于所述方法包括检测PROX1和HNF6在肝实质细胞中的表达的步骤。

14.PROX1和HNF6在制备用于鉴定具有代谢功能的肝实质细胞的试剂盒中的应用。