[发明专利]检测耐草甘膦蛋白G2-aroA的方法及其专用酶联免疫试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测耐草甘膦蛋白G2-aroA的方法及其专用酶联免疫试剂盒。

背景技术

草甘膦类除草剂是一种广谱性、非选择性除草剂，它通过抑制EPSPS(5-烯醇丙酮酰草酸-3-磷酸合酶，是植物体内芳香族氨基酸合成途径中的一个重要酶)的活性，阻断了植物莽草酸途径的生物合成，强烈抑制细胞分裂，对许多一年生和多年生杂草都具有强烈的抑制作用。由于草甘膦易于被微生物分解，在土壤中无残毒，对动物无毒害，自从1976年Roundup研制成功以来，得到了广泛的应用。但是，由于玉米等禾本科作物对草甘膦敏感，使其应用受到限制。因此，将耐草甘膦基因转入作物，不但可以扩大草甘膦的使用范围，而且可降低生产成本，保护作物免受药害，最终达到增产增收的目的。

目前，国际上在耐草甘膦转基因植物的研究方面，已经取得了突破性进展。美国孟山都(Mosanto)和Calegene等公司在基于对EPSP合成酶的编码基因aroA的研究，已获得耐草甘膦转基因大豆、玉米、油菜和棉花等作物系列品种，其中大豆等多种转基因作物已经进入商品化生产。Mosanto公司生产的耐草甘膦二型转基因玉米在2007年的播种面积预计超过3200万英亩，相当于美国玉米播种面积的40％。2004年，中国农业科学院生物技术研究所发现了一个新的耐草甘膦基因G2-aroA(中国专利，申请号03826892.2，授权公告号CN 100429311C)。目前尚没有抗G2-aroA蛋白的单克隆抗体，也未见利用G2-aroA蛋白单克隆抗体鉴别转G2-aroA基因植物的相关报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测耐草甘膦蛋白G2-aroA的酶联免疫试剂盒。

本发明所提供的酶联免疫试剂盒中含有独立包装的抗所述G2-aroA蛋白的单克隆抗体；所述G2-aroA蛋白的氨基酸序列为序列表中序列9；所述单克隆抗体由杂交瘤细胞株AntiG2-5F11产生；所述杂交瘤细胞株AntiG2-5F11在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.5772。

所述酶联免疫试剂盒中还含有分别独立包装的抗所述G2-aroA蛋白的多克隆抗体和/或所述G2-aroA蛋白标准品和/或用于标记所述单克隆抗体的标记酶；所述多克隆抗体是以所述G2-aroA蛋白为免疫原免疫脊椎动物得到的。

在本发明的一个实施例中，所述多克隆抗体具体是以所述G2-aroA蛋白为免疫原免疫家兔(体重约2kg的新西兰大耳白兔)得到的。所述G2-aroA蛋白标准品可为G2-aroA蛋白或由所述G2-aroA蛋白配制成的一系列不同浓度的G2-aroA蛋白溶液。所述一系列不同浓度的G2-aroA蛋白溶液具体可为从浓度为10μg/mL开始，按照2倍比进行稀释所得的溶液。所述G2-aroA蛋白溶液的溶剂具体可为PBST。

所述酶联免疫试剂盒中还含有分别独立包装的包被缓冲液和/或洗涤液和/或底物缓冲液和/或终止缓冲液和/或封闭液；

在本发明的一个实施例中，所述包被缓冲液具体为碳酸盐缓冲液，其溶剂为水，Na₂CO₃和NaHCO₃；溶质Na₂CO₃和NaHCO₃在所述包被缓冲液中的浓度分别为15mM和35mM；所述包被缓冲液的pH为9.6。

在本发明的一个实施例中，所述洗涤液具体为PBST，其溶剂为水，溶质为Na₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl和吐温20；溶质Na₂HPO₄、KH₂PO₄和NaCl在所述洗涤液中的浓度分别为8.3mM、1.5mM和200mM；所述吐温20在所述洗涤液中的体积百分含量为0.1％；所述洗涤液的pH为7.5。

在本发明的一个实施例中，所述底物缓冲液具体为PNPP缓冲溶液，其溶剂为水，溶质为MgCl₂和二乙醇胺；溶质MgCl₂在所述底物缓冲液中的浓度为1mM；所述二乙醇胺在所述底物缓冲液中的体积百分含量为9.7％；所述底物缓冲液的pH为9.8。

在本发明的一个实施例中，所述终止缓冲液具体为3M的NaOH水溶液；