[发明专利]一种对虾抗病毒能力测试的定量、大规模感染方法

说明书

技术领域：

本发明属于对虾抗病良种选育领域，具体地涉及一种对虾抗病毒能力测试的定量、大规模感染方法。

背景技术：

对虾常见的疾病有白斑综合病、桃拉病毒病、红体病和红腿病等，对虾疾病一直困扰着对虾养殖业的恢复和发展，在对虾抗病良种选育过程中经常需要对养殖对虾进行人工感染实验，以研究对虾对疾病的抵抗能力，特别是在对虾抗病良种选育过程中，需要对大批量对虾进行人工感染实验，记录对虾个体或家系在摄食带有病毒的饵料后的存活时间，以评判各对虾个体或家系对该病毒的抵抗力，为抗病良种选育提供有力证据。但目前对虾的人工感染方法，主要有：1)浸浴感染的方法(邱德全等。斑节对虾白斑综合症杆状病毒感染的实验模式，湛江海洋大学学报，2001年/第21卷/5期)，浸浴感染时间长，感染过程中受影响的因素较多，一般认为实验虾没有影响，在抗病选育中没有采用。2)人工注射的方法(谢数涛等.斑节对虾白斑症的发病历程，暨南大学学报(自然科学版)/2000年/第21卷/第5期)，但此感染的方法是用注射器注射入虾体内病毒液，感染操作繁琐，技术要求高。一方面，此方法与对虾自然感染的方式不符，无法反映对虾自然感染情况下的抗病；另一方面，对虾虾体较小，通过注射的方式难免对虾体造成伤害，由此可能引起虾染病而死还是由于外伤感染而死的疑问。3)混养后粗放式投喂毒饵的方法(刘凯于等.对虾白斑症病毒的初步研究，华中师范大学学报(自然科学版)/2000年/第34卷/第3期)。此方法采用所有实验个体混养在养殖池中，暂养并停止投喂1-3天后，向养殖池内投入含有病毒的饲料颗粒，并记录投喂时间，以此时间点为计算对虾个体存活时间的起点，发现养殖池内有死亡对虾立即捞出，记录死亡时间。由于中国对虾具有同类蚕食的特点，这种混养后粗放式投喂毒饵的方法在停食期间，体弱、蜕皮的对虾可能会被其他同类吃掉而丢失有关信息；另外，全池投喂的结果不能保证每尾对虾均摄食(虾蜕皮时不摄食，已蚕食同类而饱胃的虾也可能不摄食毒饵)，也不能保证每尾对虾仅摄食一次，因此无法判断对虾在实验期间是由于摄食毒饵后死亡还是由于养殖环境中的其它环境因子导致其死亡，以致不能为抗病良种选育提供准确的实验信息。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是提供一种对虾抗病毒能力测试的定量、大规模感染方法，杜绝对虾蚕食同类、避免过量感染，以解决目前对虾抗病力测试过程中因注射、粗放式投喂等原因造成外伤、同类蚕食、过量感染等缺陷，确保为抗病优良良种选育提供完整而且准确的信息。

本发明是按如下技术方案实现的：

一种对虾抗病毒能力测试的定量、大规模感染方法，具体包括以下步骤：

1)、感染前的准备选取体质健康、规格整齐，体长2.0-2.5cm的各家系对虾为测试个体，每个对虾都具有标示，水温为正常养殖期水温，按常规操作正常投喂、换水；

2)、感染源制备病源为-80℃保存的自然感染待测病毒发病的对虾。取病虾的鳃，剪碎后按约1g鳃组织：15mL溶液的比例，加入缓冲液，缓冲液的成份为：20mmol/L Tris-HCl，0.4mol/L NaCl，10mmol/L EDT A，pH7.5，用匀浆机搅打，制备成匀浆液，用双层纱布挤压过滤去粗渣，再在4℃，8000r/min离心15min去沉淀，上清液再在4℃，15000r/min离心40min，弃去上清液，沉淀加8倍体积的上述缓冲液溶解，即得待测病毒悬液，用无菌生理盐水以1∶200体积稀释待测病毒悬液，注射感染经PCR检验后的健康对虾，每尾对虾注射200L，确认已感染待测病毒后，取对虾的鳃和肌肉，用匀浆机搅匀打碎，制成适合感染对虾口径的均匀颗粒；

3)、逐尾感染将待测试对虾分别置于透明塑料容器中，塑料容器底部铺设黑色背景以便于观察，饥饿2小时后，将毒饵投入容器中，观察对虾摄食情况；

4)、数据采集及分析感染结束后，实验用对虾全部转入同一大型混养池中，正常投饵、换水，观察对虾死亡情况，从第一尾对虾死亡开始记录对虾死亡时间、体长、体重及家系编号；死亡高峰时，每个小时吸池底一次，并收集死虾置-80℃保存，实验废水施用50ppm有效氯消毒处理后排放，严格操作，以免病毒扩散，实验结束后，选择存活率较高的家系的备份留种，感染实验中长期存活的对虾同时作为抗病良种转移到新池中培育。

本发明与现有技术相比的有益效果：