[发明专利]抗体基因芯片的研制和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种应用于临床检测患者个性化肿瘤相关性蛋白质表达谱的蛋白质组技术和抗体基因芯片技术，尤其是能检测组织切片蛋白质表达谱的技术发明。

背景技术

目前所使用的蛋白质组研究的技术主要有2D电泳和质谱分析技术等，抗体芯片也有用于蛋白质组研究的报道。这些技术均十分昂贵、相关试剂不易保存、检测时间长等；检测的灵敏度较低，对于低丰度的蛋白难以检出。这些状况导致蛋白质组研究技术和成果无法直接应用于临床诊疗过程。另外目前所有的蛋白质组研究技术都无法直接用于组织切片的检测。

发明内容

相对于经典的蛋白质组技术和抗体芯片技术，抗体基因芯片制备过程简单易掌握，可长期保存于普通环境；本技术方案将抗体抗原结合反应、PCR反应和DNA芯片杂交技术有机结合起来，具有高度的特异性和敏感性，可广泛应用于临床检测患者个性化肿瘤相关性蛋白质表达谱，本技术方案也是目前唯一一种能原位检测组织切片蛋白质表达谱的技术方案。

该发明解决技术问题所采用的技术方案是：用多个不同抗体同时与肿瘤组织多种待测蛋白质结合后，经PCR扩增的标识性V-D-J序列与抗体基因芯片杂交，通过杂交结果显示肿瘤组织的蛋白质表达谱；可选择性通过免疫组织化学显示其中某些蛋白质原位表达状况。

抗体基因芯片的研制和应用过程中，通过筛选噬菌体抗体库，获得多个单克隆抗体组成特异性抗体库，同时制备相应抗体基因芯片；用特异性抗体库与肿瘤组织多种待测蛋白质结合后，经PCR扩增的标识性V-D-J序列与抗体基因芯片杂交，通过杂交结果显示肿瘤组织的蛋白质表达谱；可选择性通过免疫组织化学显示其中某些蛋白质原位表达状况。

将抗体抗原结合反应、PCR反应和DNA芯片杂交技术有机有效结合起来。

设计适当引物(通用引物或特异性引物)，扩增特异性抗体库每种抗体重链基因，按芯片实验流程制备包含每一种特异性抗体V-D-J片段的基因芯片。

按免疫组织化学方法进行特异性抗体库与肿瘤组织切片等结合反应，充分洗涤去除非特异结合的抗体；然后用E.coli.TG1与组织切片孵育37℃1小时，扩大培养后提取噬粒。

用生物素标记的引物扩增噬粒中抗体基因V-D-J片段，纯化后按DNA杂交流程与抗体基因芯片杂交，显色后分析杂交结果。

用免疫组化方法直接验证具有重要价值的目标蛋白表达丰度。

该发明的有益效果是：解决组织切片原位检测大量蛋白表达的难题，其次是将蛋白质组研究成果直接应用于临床的诊疗过程，是实现疾病个性化治疗的重要前提。批量生产，成本进一步降低，对实验室条件要求不高，可以广泛应用于基础研究和临床诊断、治疗。

附图说明

图1：是本发明的制备流程示意图。

图2：是抗体基因的应用检测流程示意图。

图3a：TG1与结合体孵育示意图。

图3b：计算菌落数评估结合抗体滴度示意图。

图3c：倍比稀释评估探针效价示意图。

图3d：杂交结果显示蛋白质表达谱示意图。

图3e：免疫组织结果示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

在图1中，从噬菌体抗体库中筛选单克隆抗体组成特异性抗体库(含20-50个抗体)，采用通用引物或特异性引物分别扩增每个抗体V-D-J片段，纯化后作为探针制备含每个抗体V-D-J片段的抗体基因芯片。

在图2中，将特异性抗体库加入检测对象(如组织切片)，洗涤后加入大肠杆菌TG1孵育，TG1扩大培养提取抗体基因，PCR扩增抗体V-D-J片段与抗体基因V-D-J片段芯片杂交，判读杂交结果显示检测蛋白质表达谱。

在图3a至图3e中，如图3a，按免疫组织化学实验流程，组织切片常规脱蜡后，加入已制备的特异性抗体库(含20个单克隆抗体)，洗涤后加入TG1孵育。如图3b，取10μl铺板通过计算菌落以估计结合抗体滴度。如图3c，TG1扩大培养提取噬粒(含结合抗体基因)，用生物素标记引物扩增抗体V-D-J片段作为探针，琼脂糖凝胶纯化探针，按1∶10倍比稀释测定探针效价。如图3d，探针与已制备抗体基因芯片杂交，结果显示相应待测蛋白质表达谱。如图3e，通过免疫组织化学验证待测蛋白质表达情况。