[发明专利]一种GLP-1受体稳定高表达细胞系的建立及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域和医药技术领域，具体涉及一种GLP-1受体稳定高表达细胞系及其在药物筛选中的应用。

背景技术

糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）是严重危害人类健康的疾病之一，患病人数正随着生活水平的提高、人口老龄化以及诊断技术的进步而迅速增加。糖尿病患者分为两种，即胰岛素依赖型糖尿病（I型糖尿病）和非胰岛素依赖型糖尿病（II型糖尿病）。其中，II型糖尿病占糖尿病患者的90% 以上。近年的研究表明II型糖尿病的主要病理和见为胰岛素抵抗和胰岛细胞功能失调所致的胰岛素分泌相对不足。

胰高血糖素样肽-1（Glucagon-like peptide-1,GLP-1）于1983年由Bell等通过对胰高血糖素原（proglucagon）基因序列进行分析时被发现。GLP-1是由远端回肠、结肠和直肠的L 细胞分泌的一种肠促胰岛素（incretins），由30个氨基酸组成，分子量约为3.355KD。研究表明， GLP-1具有促进胰岛素分泌和生物合成，抑制胰高血糖素的分泌，促进胰岛细胞增殖，抑制胰岛细胞凋亡，保存细胞对血糖的敏感性等多种生理功能。GLP-1与其受体结合后能够增加细胞内cAMP浓度并激活蛋白激酶A（PKA），通过cAMP/PKA激酶通路增强β细胞内胰岛素基因的转录和翻译，并提高对葡萄糖刺激信号的敏感性，从而增加胰岛素分泌量。GLP-1还通过与细胞上的胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1R）作用抑制胰高血糖素的分泌，或者间接通过促进胰岛素和生长抑素的分泌来抑制胰高血糖素的分泌。GLP-1作为降血糖药物受到限制的主要原因是GLP-1在体内能够迅速的被二肽基肽酶-Ⅳ（DPP-Ⅳ）所降解而失去活性。

GLP-1受体（以下简称为GLP-1R）属于GPCR（G蛋白偶联受体）B家族，属于7次跨膜的G蛋白偶联受体。GLP-1R包括一个胞外N端结构域（N-terminal domain，NT），三个胞外环状结构与（EC1-3），三个胞内环状结构域（IC1-3），七个跨膜核心结构域（TM1-7）以及胞内C末端结构域（CT）。根据两项多肽结合结构域模型分析结果，NT结构与主要负责提供多肽结合所需的能量，而核心结构域TM1-7负责结合配体的N端并将信号传递至细胞内的G蛋白。GLP-1受体与其配体的结合机制不是单一的，根据体外表达GLP-1R 全长和NT结构域的配体结合结果，GLP-1R的NT结构域（Ala²¹-Leu ¹⁴⁴）与GLP-1的结合能力很差，却能和Exendin-4正常结合，表明两种多肽与GLP-1R的结合机制不同，Exendin-4与GLP-1R的结合更多的依赖于NT结构域，而GLP-1与GLP-1R的结合与TM核心结构域关系紧密。

GLP-1R在胰岛细胞中高度表达，通过原位杂交和免疫组化实验证实GLP-1R在胰岛中主要存在于β细胞，在a细胞和细胞中表达较少。除胰腺外，GLP-1R在肠、心脏、脑、肺、肾脏等组织中都有广泛分布，用¹²⁵I标记的GLP-1（7-36）对人组织切片进行的放射自显影实验发现在中枢神经中的GLP-1R含量很高，表明这些受体可能通过改变葡萄糖敏感性参与葡萄糖代谢调节。

GLP-1R激活后会增加细胞内cAMP浓度并激活蛋白激酶A（PKA），通过cAMP/PKA激酶通路增强β细胞内胰岛素基因的转录和翻译，并提高对葡萄糖刺激信号的敏感性，从而增加胰岛素分泌量。

目前众多药企都以开发新型长效GLP-1为开发热点，旨在研发出保留GLP-1原有生物学活性的同时尽量延长其再人体内的半衰期和稳定性，以作为治疗II型糖尿病的长效治疗药物。稳定高表达GLP-1R细胞系的建立，对于研究GLP-1与其受体结合的机制、GLP-1R下游调节通路以及GLP-1受体激动剂的筛选具有广泛的意义，可以显著提高理论研究及药物筛选的效率及可信度。

发明内容

一种GLP-1受体稳定高表达细胞系的建立方法，包括以下步骤：

1)将GLP-1受体的编码基因插入真核表达载体的多克隆位点，得到重组表达载体；

2) 将步骤1得到的重组表达载体导入宿主细胞中，筛选得到稳定表达GLP-1受体的细胞系，其GLP-1受体的构建流程图如图1所示。

本发明所述真核表达载体为pcDNA3.1或pEGFP-N3。