[发明专利]微生物发酵生产乳酸脱氢酶的方法

权利要求书

1.一种微生物发酵生产乳酸脱氢酶的方法，其包括以下步骤：

(1)将产生乳酸脱氢酶的微生物进行6～10次活化，再经过产物定向驯化4～6次，使其在26～32℃环境条件下生长良好；

(2)按常规方法将产物定向驯化后的乳酸脱氢酶产生菌在26～32℃逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；

(3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的4～10％接种量接入液体发酵培养基中，在26～32℃培养60～114h时，即微生物发酵生产乳酸脱氢酶结束；

(4)将(3)的发酵液在6,000～8,000rpm离心收集液体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀；

(5)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10,000～14,000rpm离心，收集到的上清为乳酸脱氢酶粗酶液；

(6)根据不同需要和使用对象不同，将(5)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。

2.根据权利要求1所述的方法，在步骤(6)之后进一步包括：将步骤(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中菌种定向驯化培养基、液体种子培养基、产酶培养基分别为：

(1)菌株产物定向驯化培养基：葡萄糖2.5～7.5g，蛋白胨4.5～6.5g，酵母膏3.0～6.0g，丙酮酸0.2～0.7mL，蒸馏水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸汽灭菌30min。

(2)液体种子培养基：蛋白胨8～12g，酵母膏1.5～3.5g，葡萄糖2.5～8.0g，KH₂PO₄ 1.5～2.5g，K₂HPO₄ 0.5～1.5g，自来水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸汽灭菌30min。

(3)发酵产酶培养基：葡萄糖6.5～8.5g，酵母膏1.5～2.5g，蛋白胨3.0～6.5g，玉米浆12.5～16.5mL，KH₂PO₄ 2.5～6.0g，乙酸铵1.5～5.0g，丙酮酸0.2～0.6mL，吐温80 1.5～4.5mL，自来水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸汽灭菌30min。