[发明专利]微生物发酵生产纤溶酶的方法无效
申请号: | 201210106732.X | 申请日: | 2012-04-12 |
公开(公告)号: | CN102776167A | 公开(公告)日: | 2012-11-14 |
发明(设计)人: | 张庆芳;迟乃玉;窦少华;王晓辉;于爽;袁慎亮 | 申请(专利权)人: | 大连大学 |
主分类号: | C12N9/68 | 分类号: | C12N9/68 |
代理公司: | 大连智慧专利事务所 21215 | 代理人: | 刘琦 |
地址: | 116622 辽*** | 国省代码: | 辽宁;21 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 微生物 发酵 生产 纤溶酶 方法 | ||
技术领域
本发明涉及微生物学、酶工程、发酵工程、生物化学等领域,具体涉及一种微生物发酵生产纤溶酶的方法。该发明生产的纤溶酶能直接降解纤维蛋白,主要用于医疗、保健、以及其他纤溶酶应用行业,可以开发为治疗心脑血管相关疾病的功能性食品和新型药物,提高心脑血管栓塞等疾病的治疗进程、效果及安全性。
背景技术
纤溶酶(plasmin,EC 3.4.21.7)是指能专一降解纤维蛋白凝胶的蛋白水解酶,是纤溶系统中的一个重要组份。纤溶酶主要通过降解纤维蛋白和纤维蛋白原,水解多种凝血因子(II.V.VII.VIII.X.XI),使纤溶酶原转变为纤溶酶,水解补体等途径降解纤维蛋白(余望生等,临床内科杂志,1994)。纤溶酶作为生物酶制剂已经广泛应用于医疗和保健等行业中,但目前使用的纤溶酶主要是从动植物中分离提取,虽然国内外微生物发酵生产纤溶酶的研究很多,但是有关微生物发酵纤溶酶研究处于起步阶段,主要是菌种选育、产酶条件优化、酶学性质以及相关基因的克隆与表达等基础性工作(王敏等,药学学报,1998;龚勇等,微生物学报,2001;刘晨光,青岛海洋大学学报,2001;张少平等,华南理工大学学报,2010)。关于微生物发酵生产纤溶酶的产业化、规模化及应用还未见报道。微生物发酵生产纤溶酶与从动植物中分离提取相比有很大的优势,从动植物中提取纤溶酶代价昂贵,需要进行严格脱毒,工艺复杂,原料来源有限,浪费大;而微生物发酵工艺简单,可大规模生产,所需原料来源广泛,在常温常压的发酵方式下,生产成本低,微生物代谢旺盛,可以提高原料利用率,获得的酶稳定性好,产出率高,临床风险小,在节能方面有相当大的优势;这将有助于微生物纤溶酶的推广和应用(章海锋等,食品工程·技术,2008;孙月娥等,中国酿造,2010;璩竹玲等,中国海洋药物杂志,2003)。利用微生物发酵生产的纤溶酶可以开发功能性食品和新型药物用于溶解动脉血栓、治疗进展性脑梗死、不稳定型心绞痛、心脑血管血栓栓塞等疾病(王高学等,四川大学学报,2009;方璟等,长江大学学报,2010;赵连浩等,中国水电医学,2010),避免了传统方法大剂量用药引发血管出血、溶栓后血管再闭塞、药物过敏等缺点,随着现代生物工程技术的发展,临床溶栓将越来越关注微生物发酵生产纤溶酶。因此,微生物发酵生产的纤溶酶的应用将对传统的临床溶栓领域产生深远的影响,具有广阔的开发潜力和应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种微生物发酵生产纤溶酶的方法,该发明主要是微生物经过产物定向驯化后,在24~30℃液体发酵生产纤溶酶的方法,这种生产方法获得的微生物发酵纤溶酶活性可以达到150U/mL。如再经过分离和纯化,可以得到不同浓度和纯度的酶制剂。该方法生产的微生物发酵纤溶酶制剂成本低,专一性强,稳定性好,临床风险小,可以从根本上避免了利用动植物提取的高成本、原料的限制、严格脱毒等缺点。
本发明所述的一种微生物发酵生产纤溶酶的方法具体包括以下步骤:
(1)将产生纤溶酶的微生物进行6~10次活化,再经过产物定向驯化4~6次,使其在24~30℃环境条件下生长良好;
(2)按常规方法将产物定向驯化后的纤溶酶产生菌在24~30℃逐级扩大培养,制备成液体一级种子和二级种子;
(3)将液体一级种子或二级种子,按发酵液体积的3~9%接种量接入液体发酵培养基中,在24~30℃培养60~114h时,即微生物发酵生产纤溶酶结束;
(4)将(3)的发酵液在4,000~8,000rpm离心收集液体,即为粗酶液;
(5)根据不同需要和使用对象不同,将(4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化,制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
本发明中使用的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),初期活化和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。纤溶酶产生菌株(例如,CGMCC编号:1.769或1.892),菌株先活化、定向驯化后,按本发明产酶条件发酵生产纤溶酶,定向驯化后的菌株在4℃环境中可保存2个月,用10~25%甘油制成的菌悬液、在零下80℃条件下可以长期保藏。
具体实施方式
实施例一:
(1)培养基制备
①菌种活化培养基:葡萄糖10.0g,纤维蛋白20.0g,蒸馏水1.0L,pH值7.0~7.2,121℃高压蒸汽灭菌30min。
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