[发明专利]一种杂交杨树的农杆菌基因转化方法

权利要求书

1.一种杂交杨树的农杆菌基因转化方法，其特征包括下述步骤：

(1)预培养：

将717杨树腋芽或顶芽置于基本培养基上继代繁殖，培养4-6周获得组培苗；切取所述组培苗0.8-1.5cm不带腋芽的茎段，用刀片沿着茎段纵轴方向划2-3次造成伤口或切取所述组培苗的带有0.1-0.5cm²叶片的叶柄置于M1′培养基中，于24-26℃黑暗条件下预培养2-3天；

(2)菌种活化与培养：

用移液枪枪头挑取-80℃保存的农杆菌至含有抗生素的YEB固体培养基上，27-29℃倒置暗培养20-28h；挑取培养后的农杆菌在另一含有抗生素的YEB固体培养基上划线，27-29℃倒置暗培养36-48h；

挑取单菌落至含有抗生素的2-4mLYEB液体培养基的无菌试管中，150-200rpm 27-29℃暗培养12-16h；吸取0.1-1.0mL菌液至含有抗生素的50-75mLYEB液体培养基的锥形瓶中，150-200rpm 27-29℃暗培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8；

(3)侵染：

将步骤(2)获得的菌液在室温、3500-4000rpm离心10-15min，弃去上清液，将沉淀用50-75mL M液重悬，24-26℃，80-100rpm活化0.5-1h得到侵染液；按30-50个：25mL的比例将经步骤(1)预培养的茎段或带有叶片的叶柄放入所述侵染液中，24-26℃条件下80-100rpm侵染30-60min；

(4)共培养：

从侵染液中取出茎段或带有叶片的叶柄，置于无菌滤纸上吸干表面残留的侵染液，放在M1固体培养基上，24-26℃，暗条件下共培养2-3天；

(5)延迟选择：

取出步骤(4)共培养的茎段或带有叶片的叶柄，先用去离子水在180-220rpm下洗涤4-5min，洗涤2-3次，接着用浓度为350-500mg/L的头孢霉素-去离子水溶液洗涤4-5min，洗涤2-3次，用无菌滤纸上吸干表面水分并转移至CIM延迟选择培养基中，24-26℃暗培养10-11天，取出更换至新的CIM延迟选择培养基上继续24-26℃暗培养10-11天，得到带有愈伤组织的茎段或叶柄；

(6)诱导不定芽：

将所述带有愈伤组织的茎段或叶柄转移至SIMa筛选培养基中，光照条件下进行培养，每15-20天更换一次培养基；待长出绿色愈伤组织0.2-0.5cm²，取出绿色愈伤组织至新鲜SIMa筛选培养基中培养，待绿色愈伤组织表面开始长出不定芽；将带有不定芽的绿色愈伤组织转移到含有SIMb筛选培养基的组培瓶中，直到不定芽生长至1-2cm；

(7)伸长培养：

切割留有少量愈伤组织的呈玻璃化状态的不定芽，转移至含有SEM筛选培养基的组培瓶 中进行伸长培养，培养2-4周，获得表型趋于正常的芽；

(8)诱导生根及检测：

取步骤(7)获得的芽，切去底部膨大部位，转入RM培养基中，诱导生根，从已生根的再生杨树上剪取叶片提取基因组DNA，并进行全基因组PCR检测，验证农杆菌基因转化了的杂交杨树。

2.根据权利要求1所述的一种杂交杨树的农杆菌基因转化方法，其特征在于步骤(1)中所述M1′培养基的组成为：MS盐4.4g，蔗糖20-30g，生长素NAA 1.86mg，细胞分裂素2ip1.02mg，pH＝5.6-5.8，琼脂7-7.2g，加水至1L。

3.根据权利要求1所述的一种杂交杨树的农杆菌基因转化方法，其特征在于步骤(2)中所述农杆菌为C58/pMP90/pH7GWIWG2(I)，所述抗生素为：利福平、庆大霉素和壮观霉素，在YEB固体培养基或YEB液体培养基中利福平的浓度为25-50mg/L、庆大霉素的浓度为20-30mg/L、壮观霉素的浓度为30-50mg/L。

4.根据权利要求1所述的一种杂交杨树的农杆菌基因转化方法，其特征在于步骤(3)中所述M液的组成为：MS盐4.4g，蔗糖20-30g，生长素NAA 1.86mg，细胞分裂素2ip 1.02mg，pH＝5.6-5.8，乙酰丁香酮19.86mg，加水至1L。