[发明专利]一种产角蛋白酶的基因工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种产角蛋白酶的基因工程菌及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

角蛋白酶(Keratinase)是一种可以特异性降解角蛋白的酶类，由细菌、放线菌和真菌等多种微生物产生。羽毛作为家禽饲养和屠宰工业的副产物每年产量巨大，且蛋白质和氨基酸含量丰富，是潜在的优良蛋白质资源。羽毛的合理利用一方面可以减少废弃物对环境的污染，同时可以作为一种饲科蛋白质应用于畜禽的饲养。在传统利用羽毛过程中主要采用酸碱水解。热降解等方法，前者存在污染环境问题，后者对能源消耗比较大，且可以破坏部分氨基酸，降低了产品的营养价值。其他常见的角蛋白为动物的毛发，如牛毛、羊毛和人发等，这类角蛋白质部分作为商业原料进行加工外，其余多作为废物处理，也造成了环境的污染和蛋白资源的浪费。角蛋白酶能使角蛋白降解为多肽和氨基酸，既可用于农业肥料的生产，又可作为畜禽的饲料蛋白源；角蛋白酶是皮肤真菌重要的侵袭因子，其在皮肤病治疗方面的研究还有待于进一步挖掘。另外，角蛋白酶可“消化”导致疯牛病和人类克雅氏症的毒蛋白，从而可应用于医疗和实验仪器的净化；它还可用于皮革脱毛鞣制，配制润肤露、浴皂、洗发水和脱毛膏等美容品。

目前关于角蛋白酶的研究主要集中于生产菌株的筛选以及相关酶性质的研究。然而，在这些角蛋白酶产生菌中只有很少的菌株具有商业开发价值。在异源宿主中表达也存在许多问题需要解决，如表达蛋白以包涵体形式出现；这种异源表达的蛋白有时会对宿主菌产生毒性，限制宿主菌的生长，而且，在表达量积累的过程中，这种碱性蛋白酶还会造成自身的降解；构建的重组质粒有时很不稳定，在表达过程中容易丢失，这样就造成蛋白表达量的降低或消失。构建合适的载体和选择正确的宿主是这类蛋白表达的关键。

发明内容

本发明提供了一种产角蛋白酶的基因工程菌，是将角蛋白酶基因导入枯草芽孢杆菌得到的基因工程菌，已于2012年3月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉、武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2012066，分类学命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600-pMA 0911-ker。

本发明还提供了一种产盐水解酶基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

1)采用PCR方法或化学全合成方法获得ker基因；

2)将ker基因连接到大肠杆菌表达载体pMA 0911，得到重组载体pMA 0911-ker；

3)重组载体转化Bacillus subtilis WB600。

PCR方法引物序列如下：

ker1-F：5’-GGAATTCCATATGATGAGGAAAAAGAGTTTTTGG-3’

ker1-R：5’CGCGGATCCTTATTGAGCGGCAGCTTCG-3’

PCR反应体系：0.2mL PCR管中按顺序加入以下试剂：5×prime STAR PCR buffer II(Mg²⁺plus)5μl；DNTP Mixture 4μl；模板DNA 1μl；上下游引物各1μl；Taq酶0.5μl；加双蒸水至终体积为50μl。

PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，61℃退火15s，72℃延伸1min 20s(30个循环)；72℃延伸10min。

将胶回收纯化后的PCR产物用Nde I和BamHI酶切后连接到枯草芽孢杆菌表达载体pMA0911，得到重组载体pMA 0911-ker，转化Bacillussubtilis WB600，经筛选鉴定获得重组菌Bacillus subtilis WB600-pMA 0911-ker。

角蛋白酶酶活测定方法：将发酵液离心10min(10000×g，4℃)取发酵上清液，吸取200uL适当稀释的酶液，加入300uL 0.05mol/L gly-NaOH缓冲液(pH9.0)溶解1％的底物(角蛋白)，50℃培养20min，加入500uL 4M TCA溶液以终止反应。离心10min，吸取200uL上清液移入到新的试管中，后依此加入1mL福林酚试剂和200uL 0.5M Na₂CO₃后50度显色15min。空白为在加入酶液的同时，加入500uL TCA溶液，经过相同过程反应的过滤清液作为空白。在660nm处检测吸光值，根据酪氨酸标准曲线定义每20min内释放1ug酪氨酸定义为一个酶活单位。