[发明专利]一种添加羧化因子制备丁二酸的发酵方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备丁二酸的发酵方法。

背景技术

丁二酸(succinic acid)被广泛应用于医药、农药、染料、香料、油漆、食品和塑料等行业，同时作为优秀的碳四平台化合物，可用于合成1，4-丁二醇，四氢呋喃，γ-丁内酯等有机化学品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)类生物可降解材料，具有巨大的市场潜力。

作为生物炼制产品工程中最重要的碳四平台化合物，目前丁二酸生产主要是以丁烷为原料的石化法，采用的是由丁烷经顺丁烯二酐电解生产。而生物法是利用细菌发酵将二氧化碳固定，并将糖转化为丁二酸的生物技术，与传统石化法相比，生物基丁二酸有如下优势：(1)采用生物发酵生产丁二酸的代谢路径明确，代谢产物简单，因此结晶产物丁二酸的纯度高，不含有不饱和的二元酸和单酸，因此作为聚合单体质量高，而石化法丁二酸是在一系列催化剂作用下，经氧化、加氢、还原等步骤得到的，因此产品丁二酸中会含有微量的不饱二元酸和单酸，这些杂质对于丁二酸与二元醇聚合生产聚酯是不利的。(2)生物法丁二酸生产中每生产1t丁二酸，将会有0.37t的CO₂被菌体利用，有利于减少温室气体的排放。(3)生物合成丁二酸可利用可再生生物质资源，如各种植物秸秆废弃物等作为生产原料，可利用丰富的农林生物质资源，确保生物基丁二酸不受石油价格波动的影响。(4)生物法制备丁二酸可以减少石油、煤等不可再生资源的消耗，达到节能减排的效果，为我国循环经济的发展和绿色GDP增长作出重要贡献。

丁二酸的生产菌株主要包括产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、重组大肠杆菌(Escherichia coli)和产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirilum succiniciproducens)。大肠杆菌由于遗传背景清楚、易操作、易调控、培养基要求简单和生长迅速等优点，近年来被广泛用于研究以获得产丁二酸优秀菌株。

重组大肠杆菌在厌氧发酵过程中积累有机酸，因此在整个发酵过程中需要添加酸中和剂控制pH值在一定的范围，其中效果较好的酸中和剂为碳酸镁、碳酸钠、氢氧化钙。Jiang等人在利用E.coli AFP111两阶段发酵生产丁二酸过程中，当采用合成培养基并且碳酸镁作为酸中和剂时丁二酸的生产速率达到1.8～2.5g/Lh(Applied and Environmental Microbiology.2010，76(4)：1298-1300)。虽然采用碳酸镁作为酸中和剂获得了较高的生产水平，但其价格昂贵，是碳酸钠价格的2倍多，阻碍了丁二酸的工业化进程。因此采用碳酸钠作为酸中和剂将可大幅降低丁二酸的生产成本，但随着发酵的进行钠离子浓度将不断升高，在发酵后期高浓度的钠离子将可抑制丁二酸生产菌株的代谢性能，导致丁二酸的生产速率大幅下降，丁二酸平均生产速率在11～1.3g/Lh。Lu等人在在利用E.coli AFP111两阶段发酵生产丁二酸过程中，当采用合成培养基并且氢氧化钙作为酸中和剂时丁二酸的生产速率分别为1.5～1.9g/Lh(Journal of Biotechnology.2009，143：213-223)。因此，需要对碳酸钠作为酸中和剂的发酵体系进行优化，提高丁二酸的生产速率。

发明内容

本发明提供一种添加羧酸因子制备丁二酸的发酵方法，可在单独以碳酸钠为中和剂的情况下，实现丁二酸的高生产速率生产。

所述添加羧化因子制备丁二酸的发酵方法为，在厌氧条件下重组大肠杆菌发酵生产丁二酸，以碳酸钠作为酸中和剂采用反馈补料的方式控制pH值在6.4～6.8，同时在转厌氧初始添加羧化因子，所添加的羧化因子为6mg/L以上的烟酰胺和/或8mg/L以上的泛酸，所述烟酰胺或泛酸浓度为其在发酵体系中的浓度。优选，所添加的羧化因子为6～10mg/L的烟酰胺和/或8～10mg/L的泛酸，所述烟酰胺或泛酸浓度为其在发酵体系中的浓度。