[发明专利]基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物学技术领域，涉及一种靶向型免疫脂质体，还涉及该免疫脂质体的制备方法和在制药领域中的应用。

背景技术

冠状动脉内支架植入术（PCI）及经皮腔内冠状动脉形成术（PTCA）后，最主要的并发症是术后6 个月内30%-50%发生再狭窄，表现为血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）密度增加和新生内膜增厚，VSMC凋亡不足是再狭窄发生的机制之一。研究表明，增加VSMC的凋亡可以防治再狭窄。因此，针对VSMC凋亡方面的研究成为治疗再狭窄的热点领域。

腺嘌呤核苷酸转位酶（adenine nucleotide translocase，ANT）是位于线粒体内膜上的转运蛋白，参与由线粒体经内膜到胞质转运氧化磷酸化过程中的ATP 和ADP，与细胞内的能量代谢密切相关。此外，ANT还参与线粒体膜渗透性转换（mitochondrial permeability transition，MPT），从而与细胞凋亡关系紧密，但其作用与能量转运无关。ANT有4 种异构体，其中ANT1诱导细胞凋亡的作用最强，但其是否能诱导VSMC凋亡国内外尚未见报道。

细胞骨架是VSMC保持特定细胞形态和行使收缩功能的重要结构基础。平滑肌SM22α（smooth muscle 22 alpha）蛋白又称转凝蛋白（transgelin），是一种重要的细胞骨架相关蛋白，在分化型VSMC中大量表达，可通过与肌动蛋白（actin）相互作用参与细胞骨架重构和表型调节。此外，SM22α 还可作为信号分子参与VSMC的生长和细胞外基质的降解。因此，SM22α在VSMC表型转化和血管重塑性疾病发生发展中的作用日益成为人们关注的焦点。

脂质体是由一层或多层同心的脂质双分子膜包封而成的球状体，可以包裹多种物质（如药物、核酸等）并将其转入多种类型的细胞中，具有延长包裹物的作用时间、增加细胞对包裹物的摄取量、提高疗效、减少毒副作用等特点，但其缺乏主动靶向性。免疫脂质体是一种表面结合有抗体或抗体片段等物质的脂质体，其借助抗体或抗体片段与靶细胞表面抗原的特异性结合，可以特异性识别并结合靶细胞，使脂质体在靶区释放包裹物，从而实现主动靶向功能。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体，可以主动靶向VSMC，在细胞中表达ANT1，诱导VSMC凋亡并抑制其增殖，从而发挥抗血管狭窄的作用；目的之二在于提供所述基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体的制备方法，操作简便易行；目的之三在于提供所述基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体在制药领域中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体，在内部包封有ANT1重组真核表达载体的脂质体表面结合有抗SM22α单克隆抗体，所述ANT1重组真核表达载体中含有核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的ANT1基因。

进一步，所述ANT1重组真核表达载体是将ANT1基因插入真核表达载体p3xFLAG- CMV-14的多克隆位点中而得到。

进一步，所述脂质体是以质量比为5:1的卵磷脂和胆固醇为原料制得。

2、所述基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体的制备方法，包括以下步骤：

a、ANT1重组真核表达载体的制备：将核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的ANT1基因插入真核表达载体p3xFLAG-CMV-14的多克隆位点中，制得ANT1重组真核表达载体p3xFLAG- CMV-14/ANT1；

b、ANT1重组真核表达载体的脂质体包封：将卵磷脂和胆固醇溶解于乙醚中，减压蒸馏除去有机溶剂，水浴超声，再加入p3xFLAG-CMV-14/ANT1溶液，在干冰和42℃水浴中反复冻融并通过孔径为100nm的薄膜挤出器，用核酸酶Dnase I和exonuclease III降解未包封入脂质体的p3xFLAG-CMV-14/ANT1，再用琼脂糖凝胶柱分离除去被核酸酶降解的p3xFLAG- CMV-14/ANT1，即制得包封有p3xFLAG-CMV-14/ANT1的脂质体；

c、包封有ANT1重组真核表达载体的脂质体与抗SM22α单克隆抗体的连接：将抗SM22α单克隆抗体经巯基化修饰后，与包封有p3xFLAG-CMV-14/ANT1的脂质体在室温下振摇连接过夜，再用琼脂糖凝胶柱分离除去未连接的抗SM22α单克隆抗体，即得基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体。