[发明专利]转基因水稻TT51-1核酸定量检测试剂盒

说明书

技术领域：

本发明涉及一种转基因水稻TT51-1核酸定量检测方法和检测试剂盒。

背景技术：

转基因作物在商业化种植和应用迅速发展的同时，给转基因作物的安全管理带来了挑战。转基因产品成分检测是转基因生物安全管理和标识的重要内容。

转基因水稻TT51-1(BT63)是一种抗虫水稻，农业部已于2009年8月发放了其在湖北省的生产应用安全证书。有关TT51-1的转基因检测方法有如下报道：

Cao Y.等发表在J Agric Food Chem杂志上的文章《Characterization of the transgenic rice event TT51-1 and construction of a reference plasmid》报道了对转基因水稻TT51-1的定性检测方法。Wang C等发表在J Agric Food Chem杂志上的文章《Evaluation of four genes in rice for their suitability as endogenous reference standards in quantitative PCR》报道将SPS基因用于TT51-1检测中的内标准基因。以上两种方法均不能对转基因水稻TT51-1进行精确定量检测。

为了保证转基因作物定量检测方法的结果准确可靠，还需要在检测方法中使用相关标准品和质控品。但到目前为止针对转基因水稻TT51-1的精确定量检测方法的内容还尚未见到。

发明内容：

本发明的目的是提供一种精确定量检测转基因水稻TT51-1及其制品的方法和检测试剂盒，且灵敏度高、特异性强、准确度好，精确度高。

本发明首次建立了一种精确定量检测转基因水稻TT51-1及其制品的方法，为了满足转基因水稻TT51-1检测的精确定量，要求水稻内标准基因的扩增效果和扩增效率均与外源基因TT51-1相同。本发明人进行了如下工作：

①选择适合的内标准基因

分别合成了五种常用的水稻内标准基因水稻基因GOS9、PLD、SPS、RBE4、UBQ5引物后，以提取的转基因水稻TT51-1为基础，分别进行五个内标准基因和外源基因TT51-1的PCR扩增，将扩增后的PCR产物，进行电泳分析。结果发现RBE4基因的扩增产物亮度最接近外源基因TT51-1，其余四个内标准基因产物亮度都暗。

因此，确定了转基因水稻TT51-1检测的内标准基因为RBE4。

得到适合两个基因扩增的最佳条件

参考文献合成内标准基因RBE4和外源基因TT51-1的引物和探针，进行PCR体系优化，得到适合两个基因扩增的最佳条件。

我们对现有技术中关于转基因该检测方法的五个元素的配比体系上进行了优化，得出了最佳的检测PCR体系。

验证检测方法的效果

将提取的转基因水稻TT51-1基因组DNA进行系列稀释后作为模板，分别进行内标准基因RBE4和外源基因TT51-1的荧光定量PCR扩增，将每个稀释梯度浓度的模板所扩增的RBE4和TT51-1基因扩增的Ct值进行比较，结果发现：

TT51-1与RBE4的Ct值比值均在0.98到1之间，证明RBE4作为内标基因在实时荧光定量PCR检测中具有很好的效果。

RBE4的检测限和定量限分别为5个拷贝和15个拷贝，TT51-1的检测线和定量限分别为5个拷贝和10个拷贝，证明两个基因的检测灵敏度都很高。

根据上述本发明建立的检测方法，本发明还提供了一种转基因水稻TT51-1核酸定量检测试剂盒，所述试剂盒中除常规的荧光定量PCR应有的试剂、PCR酶预混液外，还含有以下成分：

内标准基因RBE4的上游引物、下游引物、探针；外源基因TT51-1的上游引物、下游引物、探针；具体详见表1。

质控品(为含量1％和5％的转基因水稻TT51-1种子粉末标准物质)

标准品：为含有不同浓度的TT51-1和RBE4基因片段的质粒分子标准物质，数量为3～8个；

尽管检测精度与标准品数量成正比，但检测成本也与标准品数量成正比。本发明人经实验证明，标准品优选数量是4～6个

在本发明一个实例中，用了5种不同浓度的标准品(分别含有10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²copy/ml的TT51-1和RBE4基因片段)。