[发明专利]一种稳定表达HBV耐药变异株细胞系及其用途

说明书

技术领域

本发明属生物技术、微生物动物细胞系领域，具体涉及一种能够稳定表达HBV耐药变异株细胞系及其用途。

背景技术

HBV细胞模型是筛选抗药物、研究其生物学特点及其与细胞间相互作用的必要工具，在研究有关发病机制、免疫机制、抗病毒药物的筛选中有重要的作用。本领域公知Hep2.2.15细胞是HBV细胞模型开发研究的里程碑，其用含2个HBV头对尾二聚体的pDolt-HBV-1重组载体转染HepG2细胞，经G418筛选后获得一个产高水平HBsAg和HBeAg的细胞克隆，其胞内外均能检测到HBV-DNA以及具有感染性的完整病毒颗粒。目前Hep2.2.15仍是应用最为广泛的HBV细胞模型。近年来以拉米夫定为代表的核苷类似物类抗HBV药物的临床应用在为慢性乙型肝炎(CHB)患者带来福音的同时，也带来了严重的耐药问题，因此，对于HBV耐核苷类药物的分子生物学机制的研究成为重中之重。在HBV耐药株逐年上升的临床背景下，HepG2.2.15显然已经不能完全满足对于耐核苷类药物HBV病毒株的研究，为研究HBV耐药的分子生物学机制以及新的抗HBV药物的筛选，需要建立一种能够稳定表达HBV耐药变异株细胞系。

现有技术公开了耐核苷类药物HBV的基因变异主要集中于反转录区(RT区)，研究显示，目前临床最广泛的耐药病毒株为rtM204V即YVDD变异，可以导致HBV对于拉米夫定(LAM)的敏感性明显下降，可低于对照野毒株越45倍左右。虽然阿德福韦(ADV)可以治疗LAM耐药患者，但ADV诱导的rtA181以及rtN236变异的耐药株相继在临床被发现，明显增加了治疗难度以及医疗成本。由于RT区核苷酸变异可能影响耐核苷类药物HBV变异株的复制能力，由HBV耐药变异株基因构建稳定表达HBV变异株细胞系的难度也相应增高。有学者在含核心启动子1.3-1.7倍体或外源性CMV启动子1.1倍体HBV真核表达载体直接诱变为耐药基因型转染HepG2细胞试图构建HBV变异株细胞系，但总体结果显示，HBV-DNA合成、HBsAg与HBeAg等病毒蛋白以及病毒颗粒释放水平明显低于Hep2.2.15细胞。至今仍未见有关适用目前严重的耐药问题研究的HBV变异株细胞系的报道。本申请在前期构建野生型以及LAM耐药变异型细胞系基础上构建了适合目前严重的耐药问题研究的耐ADV HBV细胞株。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够稳定表达HBV耐药变异株细胞系HepG2.HS181V。

本发明的进一步目的是提供该稳定表达HBV耐药变异株细胞系HepG2.HS181V的医用用途。该细胞系能用于筛选抗HBV药物、研究HBV生物学特点及其与细胞间相互作用的HBV细胞模型的建立。

本发明采用HBV真核表达质粒pREP-HBV-WT(质粒由福建医科大学分子病毒实验室林旭教授馈赠)，其载体骨架为pREP10载体，HBV复制子为含cp启动子以及完整HBV前基因组的HBV1.2倍体，并定点诱变为阿德福韦耐药基因型A181V后插入切除RSV启动子的pREP10构建成HBV真核表达质粒pREP-HBV-A181V。将该质粒转染HepG2细胞后通过潮霉素筛选后检测细胞中HBV复制、特异性抗原的表达及病毒颗粒的产生，并与HepG2.2.15细胞株相比较，确立耐药HBV细胞克隆株HepG2.HS181V的建立。经检测，结果显示该耐药HBV细胞克隆株pREP-HBV-A181V能持续表达HBsAg及HBeAg，胞内有HBV复制，并可以产生感染性HBV颗粒。与目前广泛使用的Hep2.2.15相比，该细胞系HepG2.HS181V表达HBsAg及HBeAg明显高于Hep2.2.15，细胞上清HBV颗粒水平与略低于HepG2.2.15。该细胞株已于2012年3月6日保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101，保藏编号：CGMCC No.5829，分类命名：人肝癌细胞株。

本发明中，所述的pREP10载体相对优势在于潮霉素Hygromycin抗性基因有利于细胞筛选工作以及EBNA-1基因转录蛋白能够上调含OriP复制原点的真核表达质粒中基因转录和表达。

本发明的细胞株HepG2.HS181V通过下述方法构建，

1.质粒转染HepG2细胞

①细胞培养：HepG2细胞以DMEM培养液培养，