[发明专利]一种大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法

权利要求书

1.大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法，为将常规液体培养至对数生长期的大肠杆菌，在大肠杆菌的最适生长温度下振荡扩大培养至OD₆₀₀为0.4-0.5左右，然后转入17-19℃，振荡培养0.9-11小时，再离心收集菌体后，采用氯化钙法制备感受态细胞。

2.如权利要求1所述大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法，其特征在于，具体包括下列步骤：

1)从LB平板上挑选新活化的大肠杆菌单菌落接种于LB液体培养基中，在大肠杆菌的最适生长温度下振荡培养过夜；

2)将步骤1)获得的菌悬液接种于新鲜的LB液体培养基中，在大肠杆菌的最适生长温度下振荡培养至OD₆₀₀为0.4-0.5左右；

3)将步骤2)获得的菌悬液转入17-19℃，振荡培养0.9-1.1小时；

4)将步骤3)获得的菌悬液加入无菌离心管中，冰浴后，冷冻离心收集菌体，弃上清，保留细胞沉淀；

5)用无菌的0.09-0.11MCaCl₂水溶液重悬步骤4)离心分离的菌体后冰浴；

6)将步骤5)获得的重悬液冷冻离心再次收集菌体，弃上清，保留细胞沉淀；

7)再用无菌的0.09-0.11MCaCl₂水溶液重悬步骤6)离心分离的菌体，即得感受态细胞。

3.如权利要求2所述大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法，其特征在于，步骤1)-3)中，大肠杆菌振荡培养的转速为200-250rpm。

4.如权利要求2所述大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法，其特征在于，步骤4)-5)中，冰浴的时间为8-12分钟。

5.如权利要求2所述大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法，其特征在于，步骤4)-5)中，冷冻离心收集菌体的条件为3-5℃，离心力2950-3050g，离心时间4-6分钟。

6.如权利要求2所述大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法，其特征在于，步骤5)中，CaCl₂水溶液与步骤4)所取菌悬液的体积比为1∶(9-11)。

7.如权利要求2所述大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法，其特征在于，步骤7)中，CaCl₂水溶液与步骤4)所取菌悬液的体积比为1∶(48-52)。

8.如权利要求2所述大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法，其特征在于，步骤4)所述的无菌离心管、步骤5)和7)所述的CaCl₂水溶液均经预冷。

9.如权利要求2所述大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法，其特征在于，在步骤7)之后，加入无菌甘油，使甘油最终含量达到体积百分比为15-20％，分装冻存感受态细胞。