[发明专利]胸腺素β4四联体基因及其在大肠杆菌中表达的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因工程领域的基因及其在在大肠杆菌中表达的方法，具体涉及一种胸腺素β4四联体基因及其在大肠杆菌中表达的方法。

背景技术

研究表明胸腺肽β4(thymosinβ4，Tβ4)是真核生物细胞中的一种重要的G-actin螯合因子(G-actin sequestering factor)，有许多重要生理学和细胞学功能(Goldstein等.分子医学进展，2005，11：421-429)，包括：促进细胞迁移、血管形成、细胞存活、干细胞分化、调节细胞因子、趋化因子、特殊蛋白酶、上调细胞质分子的基因表达和下调核转录因子基因表达(Huff等.2001，生物化学和细胞生物学国际期刊，33：205-220)。在皮肤疾病、眼角膜疾病、心脏病、中枢神经系统疾病和肺病临床和应用中有着重要的作用。目前科学研究和医用的Tβ4的来源主要有两种：一是从小牛胸腺提取，二是化学合成。从小牛胸腺中提取Tβ4不仅成本高，且受材料来源和提取技术的限制，其纯度不高，含量较低；同时由于人畜共患疾病，从动物牛胸腺中提取的Tβ4在临床应用存在风险。Tβ4化学合成，技术与成本限制其应用。随着基因工程的发展，利用基因工程手段生产Tβ4成为可能，也将成为一个新的方向。基因工程手段生产重组Tβ4蛋白，可以克服生物原材料提取率低或化学合成成本高的缺点。

文献《生物化学与生物物理学报，2002，34(4)：502-505》用大肠杆菌中克隆表达了Tβ4，其表达水平达菌体总蛋白30％，但其纯化步骤较为复杂，分别经过了硫酸铵盐析、Source RPC反相层析柱和Q Sepharose HP阴离子交换柱来纯化目的蛋白。文献《东南大学学报(医学版)，2007，26(4)：295-298》的研究中在大肠杆菌中高效表达了His6-Tβ4，表达产物占菌体总蛋白的40％，表达产物经过一步镍柱亲和层析即可获得分离纯化。文献《第四军医大学学报，2008，29(16)：1451-1454》选用真核分泌型表达载体Psec Tag2B，并采用脂质体转染技术瞬时转染真核SW480细胞，采用Western blot法检测Tβ4重组蛋白的表达，实现在真核细胞中表达。根据原核表达载体生产周期短，表达蛋白种类简单，操作方便的特点，将4×Tβ4基因构建到原核表达载体中，然后转化大肠杆菌菌株，在IPTG的诱导下表达目的蛋白，并且对靶蛋白进行纯化和分析。利用pET28a载体的多克隆位点的5’端和4×Tβ45’端都有6个组氨酸序列，目的蛋白的N端就带上了组氨酸标签。因此融合蛋白能够与Ni-NTA亲和柱特异结合，这样就可以利用金属亲和层析介质纯化目的蛋白，操作方便，而且得到的蛋白纯度好，得率也很高。纯化得到的4×Tβ4蛋白不仅可以作为阳性蛋白在后续试验中得到应用，更重要的是可以为今后利用植物系统表达目的蛋白在纯化方面提供参考和借鉴。现有技术中尚未有按植物偏爱密码子设计合成基因Tβ4，对基因Tβ4进行串联形成四联体即4×Tβ4以及在大肠杆菌中表达基因4×Tβ4的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种4×Tβ4基因及其在大肠杆菌中表达的方法。利用基因工程的方法将4×Tβ4基因从植物表达载体(35S::4×Tβ4)双酶切下来，胶回收获得小片段，然后再采用基因工程方法将4×Tβ4和双酶切之后的原核表达载体(pET-28a)大片段相连接获得重组质粒(pET-28a-4×Tβ4)。采用热激法将重组质粒转化到大肠杆菌中，在大肠杆菌中表达含有4×Tβ4的融合蛋白，该蛋白在皮肤和眼角膜伤口治愈和修复方面具有重要的生物活性和功能。

本发明通过以下技术方案实现：

一种4×Tβ4基因，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

一种重组载体，包括目的基因和载体，其特征在于，所述目的基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，所述载体选自质粒、粘粒或λ噬菌体中的一种。

一种如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有促细胞增殖活性的由(a)衍生的蛋白质。

一种在大肠杆菌中表达4×Tβ4功能蛋白的方法，该方法包括如下步骤：

步骤一、4×Tβ4基因的获得：

利用基因工程的方法将4×Tβ4基因从植物表达载体(35S::4×Tβ4)双酶切下来，胶回收小片段获得4×Tβ4基因片段(615bp)。

步骤二、原核表达载体pET28a-4×Tβ4的构建：