[发明专利]一种大黄欧文氏菌及其在制备低乳糖牛奶中的应用

权利要求书

1.一种大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici)E602株，该菌株已于2011年3月17日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为CGMCC No.4678。

2.一种利用根据权利要求1所述的大黄欧文氏菌E602生产低乳糖牛奶的方法，其特征在于该方法的步骤如下：

A、制备一级种子

取大黄欧文氏菌E602菌株菌液划线至含IPTG和X-Gal的营养琼脂培养基，在培养箱中于温度24-28℃下培养20-28h；从该营养琼脂培养基表面挑取蓝色有金属光泽的大黄欧文氏菌E602株单菌落，转移至4-6mL LB液体培养基中，在温度24-28℃与转速180-220r/min的条件下培养10-14h，获得一级种子；

B、制备二级种子

按照以TSA液体培养基体积计1-4％接种量，将步骤A)得到的一级种子接种至45-55mL TSA液体培养基中，在温度24-28℃与转速180-220r/min的条件下培养12-18h，获得二级种子；

C、发酵培养

按照以TSA液体培养基体积计1-4％接种量，将步骤B)得到的二级种子接种至4-6L TSA液体培养基中，在温度24-30℃、转速180-220r/min与不通气的条件下发酵12-20h，然后进行离心分离，收集含β-半乳糖苷酶的菌体；

D、分离β-半乳糖苷酶

收集在步骤C)得到的含β-半乳糖苷酶的菌体，在重悬于磷酸盐缓冲液后，将得到的重悬液于冰浴中进行超声波破碎，然后进行离心分离，收获上清液，向所得上清液中添加硫酸铵粉末，在硫酸铵饱和度达到20-60％的溶液中进行硫酸铵盐析，再进行离心分离，其沉淀物用磷酸盐缓冲液重悬，接着透析除去硫酸铵，再进行离心分离，收获上清液；所得上清液再进行阴离子交换色谱层析与凝胶色谱层析分离，于是得到纯β-半乳糖苷酶；

E、制备低乳糖牛奶

向新鲜牛乳中加入在步骤D)得到的β-半乳糖苷酶，使牛乳中β-半乳糖苷酶的浓度达到2.0-30.0U/mL，然后在温度0-40℃水浴中进行水解4-20h，得到一种低乳糖牛奶。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的超声波破碎是在超声波功率200-500w的条件下进行超声处理500-700次。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于在超声波破碎后，所述的离心分离是在18000-22000r/min与温度0-6℃的条件下进行离心20-40min。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于在硫酸铵盐析后，所述的离心分离是在8000-12000r/min与温度0-6℃的条件下进行离心8-12min。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于在如下的条件下进行离子交换色谱层析分离：DEAE FF阴离子交换柱，流动相A为20mmol/L Tri-HCl溶液，pH7.0-7.5；流动相B为20mmol/L Tri-HCl和2mol/L NaCl的溶液，pH7.0-7.5，上样流速为2-5mL/min，洗脱流速为4-8mL/min，在波长280nm处测定紫外光吸收度。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于在如下的条件下进行凝胶色谱层析分离：Sephacry S-100凝胶柱，流动相为50mmol/L磷酸盐缓冲溶液和0-100.0mmol/L NaCl的溶液，pH 7.0-7.5，上样流速为0.4-2.0mL/min，洗脱流速为0.4-2.0mL/min，在波长280nm处测定紫外光吸收度。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于在步骤D)得到的β-半乳糖苷酶在pH4.0-9.0范围内具有良好的酶活性。