[发明专利]一种鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一种鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体及其构建方法和应用。

背景技术

鸭疫里默氏杆菌是黄杆菌科里默氏杆菌属的代表种。里默氏杆菌属是新独立出来的一个属，目前对鸭疫里默氏杆菌质粒的研究还仅限于检测和序列测定。比如Chang 等对从台湾分离的鸭疫里默氏杆菌菌株研究后表明，60%（36/60）菌株中携带一种3.9 kb大小的质粒；12% (7/60)菌株中携带 6.5 kb 和 16 kb两种质粒； 5% (3/60)菌株中携带2.9kb, 16kb 和 18 kb三种质粒，另外13%菌株中无质粒。并在 GenBank上发表了3.9 kb 质粒 pCFC1的全序列。 Weng S等发表了一个5. 6 kb大小的质粒pCFC2的全序列。Chen等测定了鸭疫里默氏杆菌两种新质粒pRA0726和pRA0846的全序列。这两种质粒的同源性高的，pRA0846只比pRA0726少一个bla_OXA-209基因和一个321bp的ORF1。

穿梭质粒是能在两种或两种以上宿主中复制的质粒，鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体是指在大肠杆菌和鸭疫里默氏杆菌中均能自主复制和稳定存在，且携带的外源基因能在鸭疫里默氏杆菌中表达的质粒。以大肠杆菌为宿主，具有有利于基于穿梭表达载体的重组质粒构建与筛选、便于重组质粒的保存和操作等优势；然后将构建的重组质粒导入鸭疫里默氏杆菌，这样重组质粒可以在鸭疫里默氏杆菌中稳定存在，重组质粒中携带的外源基因也可以在鸭疫里默氏杆菌中稳定表达。鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体可用于鸭疫里默氏杆菌突变株的互补菌株构建，以及构建重组鸭疫里默氏杆菌以研制同时预防不同血清型的鸭疫里默氏杆菌感染或预防多种鸭传染病的多联疫苗。到目前为止，尚没有鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体的报道及相关专利公布。

发明内容   

本发明的目的是提供一种鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体及其构建方法和应用。

本发明的鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体能使外源基因在此载体相关元件的控制下，在鸭疫里默氏杆菌中实现表达。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

 一种鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体，其核苷酸序列为：SEQ ID NO:1。

 本发明的另一方面，所述穿梭表达载体包括如下元件：鸭疫里默氏杆菌pRA0726质粒的复制起始蛋白编码序列、鸭疫里默氏杆菌ompA基因启动子序列、大肠杆菌的复制起始序列、氨苄青霉素抗性基因、头孢西丁抗性基因和多克隆位点。

 本发明的另一方面，其是以可在大肠杆菌工程菌中稳定存在和复制的质粒为骨架改造而来，所述质粒选自pBR322、pUC19、pUC119或pCP29。本发明优选质粒pCP29为骨架进行改造。

本发明的另一方面，所述的鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭载体携带OriT序列，以利于构建的穿梭表达载体通过接合转导的方式导入鸭疫里默氏杆菌中。

 本发明的另一方面，其含有使所述表达质粒在鸭疫里默氏杆菌中稳定存在的鸭疫里默氏杆菌质粒的复制起始元件和使携带的外源质粒在鸭疫里默氏杆菌中表达的鸭疫里默氏杆菌基因的启动子，以此使外源基因可在鸭疫里默氏杆菌中稳定表达。

本发明的另一方面，所述鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭载体携带有抗性基因，以利于筛选重组质粒和携带质粒的重组细菌，所述穿梭表达载体中的头孢西丁抗性基因可替换为红霉素抗性基因或/和壮观霉素抗性基因；氨苄青霉素抗性基因可替换为氯霉素或/和卡那霉素抗性基因。

本发明的另一方面，所述穿梭表达载体中用于表达外源基因的鸭疫里默氏杆菌OmpA蛋白启动子序列可替换为鸭疫里默氏杆菌其他基因的启动子序列。

本发明的另一实施方式，一种所述的鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体在重组鸭疫里默氏杆菌中的应用，其用于抗多血清型的鸭疫里默氏杆菌病、抗鸭疫里默氏杆菌病和鸭病毒性肝炎以及鸭传染病性疾病的联合、多价重组疫苗，或者构建鸭疫里默氏杆菌突变株的互补菌株。

本发明的另一实施方式，一种穿梭表达载体的构建方法，其构建方法的步骤如下：