[发明专利]改良组织块法培养啮齿类动物切牙颈环上皮细胞的方法

权利要求书

1.改良组织块法培养啮齿类动物切牙颈环上皮细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）提取啮齿类动物下颌切牙根尖端唇侧颈环组织并消化：酶混合液中消化组织块；酶消化液是浓度为0.1% dispaseⅡ蛋白酶及浓度为0.1%Ⅰ型胶原酶混合液，消化温度为37度，消化时间为15-20min；

2）接种：消化液离心后收集组织块并接种于培养板；

3）纯化：去除成纤维细胞，获得纯化的颈环上皮细胞。

2.根据权利要求1所述的改良组织块法培养啮齿类动物切牙颈环上皮细胞的方法，其特征在于，步骤2）所述接种步骤为：

a. 含组织块消化液离心，离心温度为室温，离心速度为1000-1200r/min,离心时间为2-3min ；

b. 于六孔板滴加培养液使恰好覆盖组织块即可，显微器械均匀分离组织块于培养板培养液中；

c. 盖上盖玻片，盖玻片体积为24x24mm, 滴加培养基至2.5ml。

3.根据权利要求2所述的改良组织块法培养啮齿类动物切牙颈环上皮细胞的方法，其特征在于，所述培养液为含体积百分比为10%胎牛血清的DMEM-F12培养基。

4.根据权利要求2所述的改良组织块法培养啮齿类动物切牙颈环上皮细胞的方法，其特征在于，所述六孔板为一次性塑料培养板更有利于放置组织块，即表面涂布多聚赖氨酸，以利于上皮细胞的贴壁。

5.根据权利要求1所述的改良组织块法培养啮齿类动物切牙颈环上皮细胞的方法，其特征在于，步骤3）所述纯化步骤为：

a．胰酶在37度的条件下，预热10min;

b．弃旧培养基，无血清DMEM-F12培养基清洗细胞2次以去除残余血清；

c．加入胰酶，胰酶量为完全覆盖细胞，高度2-3mm，胰酶消化1-2min；

d．显微镜下观察梭形成纤维细胞收缩，聚集生长的上皮细胞无明显变化时,弃胰酶，含血清培养基终止消化，枪头吹吸去除成纤维细胞，添加新的完全培养基继续培养；

e．1-2次胰酶消化后，即可得到纯化的上皮细胞。

6.根据权利要求5所述的改良组织块法培养啮齿类动物切牙颈环上皮细胞的方法，其特征在于，所述胰酶为含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化液。