[发明专利]纳米粒油佐剂疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种纳米粒油佐剂疫苗的制备方法。

背景技术

新城疫是由新城疫病毒引起的一种急性、高度接触性传染病，现在几乎世界上绝大部分国家都有本病流行的报道，严重危害和威胁世界养禽业，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病。目前大多数国家都采用预防接种作为控制新城疫的主要措施。灭活疫苗的制造工艺简单、免疫原性好、易于制造多价疫苗。使用方法通常是经注射途径，进入机体后可直接引起免疫应答，但不能生长繁殖，因此比较安全、稳定。但灭活疫苗所特供的免疫力较为短暂，为完成免疫操作，需进行多次接种。

壳聚糖(chitosan，CS)是甲壳素经脱乙酰化后得到的一种带正电荷的亲水性多糖，化学名为β(1，4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，是一种来源丰富的天然的聚阳离子氨基线性多糖。它具有良好的生物学特性，无毒、无刺激性、无抗原性、组织相容性良好，在体内可降解吸收。大量的研究已证实壳聚糖具有免疫增强和免疫调节作用。经过化学改性得到的壳聚糖衍生物，其物理化学性质得到改善，使其应用范围大大拓展。通过在壳聚糖分子的-NH₂上引入亲水性强的羟丙基三甲基氯化铵基团，制备N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖(壳聚糖的衍生物)，改善了壳聚糖的水溶性，保持了分子的阳离子性能。因此以壳聚糖及其衍生物纳米粒为载体的给药方式的开发及应用研究已得到了医药界的密切关注。

发明内容

本发明提供一种纳米粒油佐剂疫苗的制备方法。

本发明纳米粒油佐剂疫苗的制备方法，按以下步骤进行：一、取5mL浓度为0.5～2mg/mL的壳聚糖溶液或5mL浓度为0.5～2mg/mL的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液，向其中滴加1.25～7.5mL新城疫L-系病毒液，搅拌均匀，获得溶液A；二、将溶液A在室温、无菌条件下以900～1300r/min磁力搅拌30s，然后向溶液A中滴加2.5mL浓度为0.5～3mg/mL的三聚磷酸钠，搅拌均匀后匀速滴加1mL pH值7.4的PBS缓冲液，搅拌均匀后再匀速滴加1mL的司班-80，获得溶液B；三、将溶液B于4℃、13000r/min离心30min，吸取上清液，为溶液B₁，沉淀经去离子水悬浮，为溶液B₂；四、将94份注射用白油于160℃高温灭菌30min，然后加入6份司班-80，在160℃维持10min，然后冷却至室温，得溶液C₁；取96份溶液B₁，加入4份吐温-80，混合均匀，得溶液C₂；五、将溶液C₁置于组织捣碎器内搅拌，同时滴加溶液C₂，于8000～10000r/min搅拌5～20min，得溶液C；六、将溶液C置于磁力搅拌器内搅拌，同时滴加溶液B₂，于900～1300r/min搅拌5～15min，即得到纳米粒油佐剂疫苗；其中步骤五中溶液C₁与溶液C₂的体积比为1～3∶1；步骤六中溶液C和溶液B₂的体积比是1～2∶1。

壳聚糖和N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖都是带正电的高分子，因而能够与带负电的高分子发生静电相互作用。利用壳聚糖和N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的游离氨基与交联剂三聚磷酸钠的阴离子发生分子间或分子内交联反应，从而形成壳聚糖纳米粒。该反应条件温和，不使用任何有机溶剂；用离子交联法制备的壳聚糖纳米粒子和N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒子粒径比较均匀，介于250～900nm之间，纳米粒子表面带有正电荷；对疫苗具有很高的负载能力。纳米粒的比表面积大、表面反应活性高、表面活性中心多、黏附能力强等这些优异性质为疫苗研究提供了新的思路。

本发明制备载病毒纳米粒粒径小，包封率高、载药量大、制备条件温和、制备工艺简单，生产成本较低，易于规模化生产。本发明制备载病毒纳米粒油佐剂疫苗黏度低，颗粒均匀，稳定性良好，呈乳白色。本发明以壳聚糖及其衍生物制成的载病毒纳米疫苗同时含有裸病毒粒子和缓释微粒，在免疫前期主要是裸病毒粒子刺激免疫系统产生抗体，一段时间后缓释微粒开始释放被包裹的抗原，不断地刺激免疫系统。

附图说明