[发明专利]碱性磷酸酶标记抗体的方法

说明书

[技术领域]

本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种碱性磷酸酶标记抗体的方法。

[背景技术]

随着酶联免疫检测技术的发展，寻求一种简捷高效的酶标记抗体技术越来越重要。碱性磷酸酶(简称AP)作为一种免疫诊断试剂应用广泛的酶，将其偶联至抗体上，是诊断试剂开发中至关重要的一步。将标记抗体的方法基本上分为两类。一类用双功能基团的化合物使酶与抗体随机偶联，如戊二醛一步法。由于酶分子上游离氨基极少，而抗体分子上氨基则相对较多，为了弥补这一缺陷，往往采用8-12个酶分子与1个抗体分子的比值进行调整。戊二醛二步法的原理，主要是AP的氨基极少，而加入的戊二醛分子数相对较多，当戊二醛中的一个醛基与酶分子上的一个氨基结合后，则余下的一个醛基再与另一酶分子上的氨基作用的可能性极少，故很少产生酶与酶间的偶联。当除去未作用的戊二醛后，己醛化的酶与抗体作用而成为结合物，但这一方法标记效果也并不理想。另一类用过碘酸钠氧化酶分子中的含糖部分使酶本身产生多个醛基，酶的活性中心未受影响或影响不大，而醛化了的酶再与待标记的抗体作用即可获得结合物。这一方法由Nakane等首创，其特点是标记效果高而所得的结合物分子量较大。上述方法除标记效果较差的戊二醛一步法外，操作均较为复杂。

本发明结合以上标记方法，对酶氧化的试剂，缓冲液，氧化时间进行了优化，对操作过程中涉及到的透析繁琐操作进行了方法改进，简化了操作，缩短了时间。在此基础上实现了进一步提高标记效果，操作简便，稳定的碱性磷酸酶标记抗体的方法。

[发明内容]

本发明为了克服现有技术的不足，提供了一种标记效果好、操作简单的碱性磷酸酶标记抗体的方法。

为了实现上述目的，本发明设计了一种碱性磷酸酶标记抗体的方法，采用如下步骤：

A)将5mg碱性磷酸酶溶解在含量为0.5ml浓度为0.05M，PH值为3.6-6.6的NaAc溶液中，使碱性磷酸酶的浓度为3-10mg/ml；

B)向步骤A中的酶溶液内加入等体积的过碘酸钠溶液，并在室温为4摄氏度的条件下进行氧化，氧化时间为20min；

C)向氧化后的酶溶液内，加入与步骤A所得溶液等体积的乙二醇-NaCl溶液；

D)向步骤C中的溶液内，加入含量为1.5ml的冰冷无水乙醇，混匀，并在室温为-20℃的条件下静置1小时，4000g离心10min，得到氧化好的酶；

E)用含量为0.5ml浓度为0.05M，pH值为8-10的碳酸盐缓冲液溶解沉淀步骤D中得到的酶，并加戊二醛0.1ml，混匀；

F)按质量比，酶∶抗体的比例范围为1∶1至1∶4的比例，加入待标记的抗体溶液进行反应，反应时间为1-3小时；

G)按质量比，NaBH4∶酶的比例范围为0.1∶1至0.2∶1的比例，加入NaBH4溶液，室温放置1-3小时；

H)加入0.6ml的冰冷无水乙醇，并在-20℃的室温下静置1小时，4000g离心10分钟；

I)按所需酶标抗体浓度用PBS溶解或冻干保存。

所述乙二醇-NaCl溶液的配方为NaCl，乙二醇和水。

所述的NaCl的含量为22g，乙二醇的含量为2.3ml，水的含量100ml。

所述待标记的抗体溶液为HbcAb的PBS溶液。

本发明同现有技术相比，对酶氧化的试剂，缓冲液，氧化时间进行了优化，对操作过程中涉及到的透析繁琐操作进行了方法改进，简化了操作，缩短了时间。从而进一步提高了标记效果。

[附图说明]

图1为本发明实施例一中表1的线形图。

图2为本发明实施例二中表2的线形图。

图3为本发明实施例三中表3的线形图。

图4为本发明实施例四中表4的线形图。

[具体实施方式]

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

实施例一：

A)将5mg碱性磷酸酶溶解在含量为0.5ml浓度为0.05M，PH值为5.6的NaAc溶液中。

B)向步骤A中的酶溶液内加入0.5ml浓度为0.06M过碘酸钠溶液，并在室温为4摄氏度的条件下进行氧化，氧化时间为20min。

C)向氧化后的酶溶液内，加入0.5ml乙二醇-NaCl溶液。乙二醇-NaCl溶液的配方为，称取22g NaCl，加2.3ml乙二醇，再加水至100ml制得该溶液，室温可长期保存。