[发明专利]一种普鲁兰多糖的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种普鲁兰多糖的定性和定量的简便检测方法，属于生物技术领域。

技术背景

短梗霉多糖(pullulan)，中文译为普鲁兰，也叫普鲁兰多糖、茁霉多糖、普聚多糖或茁霉糖，普鲁兰多糖是以淀粉为原料，通过黑酵母菌的一种出芽短梗霉发酵所产生的胞外多糖，是无味无嗅的白色粉末。其化学组成主要是由α-1.4葡萄糖苷键连接的聚麦芽三糖，分子结构中含1/3的α-1.6葡萄糖苷键，2/3的α-1.4葡萄糖苷键。该多糖易溶于水，安全无毒、可食用、低热值、耐酸碱、可塑性好、成膜性好、簿膜隔气性佳。因其在自然界可被微生物降解利用，不会引起环境污染，故被誉为无公害塑料。

目前普鲁兰多糖的研究集中在发酵菌种的选育、发酵过程优化和发酵液提取方面的研究，普鲁兰多糖的检测方法也多研究对于发酵液中多糖含量的测定，鲜有对于普鲁兰多糖产品的检测方法报道。

本发明提供一种简便的普鲁兰多糖的定性和定量的检测方法，相对于现有的常规多糖检测方法，具有以下的创新性：

1、本发明在对于普鲁兰多糖定性检测中，根据普鲁兰酶的专一性，和普鲁兰多糖是由多个麦芽三糖组成的性质，采用薄层色谱法，对普鲁兰多糖的酶水解液、麦芽三糖以及普鲁兰多糖进行薄层色谱对比，从而对普鲁兰多糖进行定性。本发明方法操作简便，所使用仪器简单，鉴定时间小于0.5h。

2、本发明在对于普鲁兰多糖定量检测中，采用的蒽酮-硫酸法较之现有常用的苯酚-硫酸法具有更高的精密性，且本方法不仅试用与普鲁兰多糖产品的检测，同样适用于发酵过程中发酵液中普鲁兰多糖含量的测定，所用仪器简单，操作简便。

本发明的具体步骤如下：

(1)定性检验步骤如下：

取普鲁兰酶溶于柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液中，将酶液平均分为2份，加入普鲁兰多糖标准品、样品Y，在培养箱中保温酶解，将酶解液、标准麦芽三糖和普鲁兰多糖溶液为对照在硅胶薄板展层，展层完毕后将显色剂喷于硅胶板上，加热显色，若样品溶液与普鲁兰多糖标准品溶液在薄层层析图谱中显色在同一水平位子上且样品酶解液、普鲁兰多糖标准品酶解液和标准麦芽三糖溶液在薄层层析图谱中显色在同一水平位子上，其他位子并无显色的，即可证明样品即为普鲁兰多糖

(2)定量检测步骤如下：

蒽酮-硫酸试剂的制备：精密称取蒽酮200mg于100mL容量瓶中，加入浓硫酸直至蒽酮完全溶解完，再加入浓硫酸定容至刻度。

对照品溶液的制备：精密称取85℃干燥至恒重的普鲁兰多糖标准品，配制成0.1mg/mL的普鲁兰多糖标准溶液。

标准曲线的制作：精密量取对照品溶液0、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL置于含塞试管中，蒸馏水补至1.0mL，分别加入蒽酮-硫酸试剂4.0mL，充分摇匀后置于85℃水浴中显色，充分显色后，于550nm波长处测定各浓度溶液的吸光度，以标准葡萄糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，计算出标准曲线回归方程。

样品普鲁兰多糖含量的测定：精密称取普鲁兰多糖样品，添加蒸馏水配制成样品C₁mg/mL溶液，精密量取样品溶液Y mL，置于含塞试管中，蒸馏水补至1.0mL，加入蒽酮-硫酸试剂4.0mL，充分摇匀后置于85℃水浴中显色，充分显色后，于550nm波长处测定各浓度溶液的吸光度A₁，将A₁带入标准曲线回归方程，得到其相对应的标准品量C₂，普鲁兰多糖样品的纯度P计算公式如下：

P=C1×YC2×0.1×100%.]]>

说明书附图

图1实施例中蒽酮-硫酸法普鲁兰多糖标准曲线。

具体实施例

下面通过实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，所用术语从事生物技术行业的技术人员均能读懂。

实施例1

(1)定性检验：