[发明专利]一种获得硬叶兰种子萌发有效共生真菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及获得兰科植物种子萌发有效共生真菌的方法，具体来说涉及一种利用硬叶兰(Cymbidium bicolor)原生地收集的枯枝落叶、树皮、苔藓和腐殖质等作为培养基质，在实验室培养诱导种子萌发，获得原球茎，再从原球茎中分离、培养和筛选出种子萌发有效共生真菌的方法。

背景技术

兰科植物的种子非常细小，仅有发育不完全的胚，在自然条件下种子萌发需要依靠特定的共生真菌来获取营养物质。目前兰科植物种子的萌发，多采用人工培养基在无菌条件下进行非共生萌发，萌发率虽高，但在进行濒危种类野外回归时，幼苗移植到自然环境中存活率较低，并且由于无法与自然界中的真菌建立共生关系从而导致后续生长严重受限。通过种子和其有效萌发真菌在自然条件下的共生萌发能很好的解决这一问题。有效真菌的获得目前多采用从兰科植物野生植株的根中分离，但由于兰科植物根中存在着大量作用未知的内生真菌，这使得种子萌发有效真菌的筛选和分离变得复杂而繁琐，同时，不同兰科植物根中的真菌与种子萌发阶段的有效共生真菌是否相同目前仍不确定。因此，获得种子萌发的有效共生真菌是开展珍稀濒危兰科植物回归的关键环节。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种获得硬叶兰种子萌发有效共生真菌的方法，为实现硬叶兰的野外回归创造条件。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

除非另有说明，本发明所采用的百分数均为重量百分数。

本发明的技术方案主要是基于以下认识：

我们收集硬叶兰原生地植株周围的枯枝落叶、树皮、苔藓和腐殖质等作为培养基质，和硬叶兰的种子在实验室进行迁地共生萌发，诱导种子萌发产生原球茎，将获得的原球茎表面灭菌后在无菌条件下用人工培养基培养，诱导原球茎中的内生真菌生长，待长出菌丝时，进行真菌的纯化，获得纯菌落，并进行真菌的分子鉴定和保存。将获得的真菌和硬叶兰的种子进行共生萌发培养，设置对照实验，以检验所获得的真菌对硬叶兰的种子萌发的有效性，结果表明所获得的真菌是硬叶兰种子萌发的有效共生真菌，从而实现了本发明的目的。

一种获得硬叶兰种子萌发有效共生真菌的方法，包括以下的步骤：

(1)在硬叶兰花期进行人工异交授粉，果实成熟但果荚尚未裂开时收获果实，将种子干燥后用无菌的密闭玻璃容器置于-20℃条件下保存，待用；

(2)收集硬叶兰成年植株根部20cm范围内的枯枝落叶、树皮、苔藓和腐殖质制成培养基质，分装在培养皿中，在基质上放置一层无菌尼龙网布，用无菌蒸馏水使培养基质的水分达到饱和，每个培养皿中再放置10块无菌尼龙网片，在每个尼龙网片上均匀播撒硬叶兰种子，将播种好的培养皿放入人工气候箱内进行培养；

(3)在培养过程中，每周进行观测，记录种子的萌发情况，当观测到有种子萌发时，记录每一阶段种子或原球茎的数量，培养30～40天后获得原球茎；

(4)将获得的原球茎依次用自来水冲洗，次氯酸钠溶液消毒，无菌水漂洗后切成两半，切口面贴于马铃薯葡萄糖培养基PDA上进行培养；

(5)原球茎切口处长出菌丝时，用无菌接种针不断地挑取真菌菌落边缘处的菌丝到新的PDA培养基上，转移3～5次后，得到纯菌落；

(6)将消毒后的硬叶兰种子放入无菌水中制成均匀的悬浮液，在灭菌后的燕麦琼脂培养基表面放置两张无菌滤纸，分别吸取150微升的种子悬浮液均匀地散布在两张滤纸条上；在培养基中心接种含有不同来源的单一共生真菌纯培养物的琼脂块，同时设置不接菌的对照处理组，每个处理10个重复，用封口膜密封后置于人工气候箱中培养；

(7)每周观察1次不同处理的种子，记录种子萌发数量及萌发时间，并对种子萌发和原球茎发育情况进行分级，记录每一阶段内种子或原球茎的数量，通过和不接菌处理组的对比，筛选出硬叶兰种子萌发的有效共生真菌。

所述的无菌尼龙网布孔径为45μm。

上述步骤中，步骤(1)所述的种子干燥并保存前，用75％的酒精对果荚表面进行消毒3～5分钟后，用无菌水清洗3～4次后用无菌刀片切开果实取出种子。

步骤(2)所述的收集的枯枝落叶、树皮、苔藓和腐殖质等，放在阴凉处自然风干后，用家用搅碎机加入无菌蒸馏水充分搅碎，混合均匀后作为培养基；所述的培养条件为：光照强度为2000Lx-3000Lx，温度25℃±2℃，光周期12h/12h L/D。

步骤(3)所述的在培养过程中，确保每个培养皿中的培养基质保持湿润，但处于水分不饱和的状态。