[发明专利]一种检测狂犬病毒属病毒的CODEHOP RT-PCR试剂及方法

说明书

技术领域

本发明涉及狂犬病毒的检测技术，具体涉及一种检测狂犬病毒属病毒的CODEHOP RT-PCR试剂及方法。

背景技术

狂犬病毒属分为7个基因型：狂犬病病毒（classical rabies virus），拉各斯蝙蝠病毒（Lagos bat virus），莫科拉病毒（Mokola virus），杜文海格病毒（Duvenhage virus），欧洲蝙蝠狂犬病毒1型（European bat lyssavirus types 1）, 欧洲蝙蝠狂犬病毒2型（European bat lyssavirus types 2 ），澳大利亚蝙蝠狂犬病毒（Australian bat lyssavirus）。国内流行的野毒株为基因1型，近十年来中国狂犬病的发病率及死亡率一直维持在每年超过2000人的高位。基因2型~6型仅在非洲和欧洲发现，5型和6型在欧洲蝙蝠中比较普遍，虽感染人的病例不多，但几乎每型病毒都曾致死人。考虑到欧亚大陆的连续性和国际贸易的频繁往来，无法排除其余基因型狂犬病毒的传入。目前，狂犬病毒的检测方法主要有病毒分离、实验动物攻毒、血清学检测方法和基因检测方法。基因检测方法主要是反转录聚合酶链式反应（RT-PCR），如授权公告号为CN 101153344，名称为狂犬病毒套式RT-PCR检测方法及检测试剂盒的发明专利，就公开了以外套PCR预混体系和内套PCR预混体系的RT-PCR技术，可以完成全部7个基因型的检测，外套引物扩增产物大小是845bp，内套引物扩增产物大小是371bp，内套引物是以不同基因型RV特点设计的简并引物。该发明专利虽然可检测所有狂犬病毒属的基因型，但需要外套PCR预混体系和内套PCR预混体系二种检测试剂共同检测，检测方法复杂，检测时间也较长，且不能有效确认具体基因型，更无法鉴定狂犬病毒属内的未知病毒或可能出现其他基因型的病毒。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测狂犬病毒属病毒的CODEHOP RT-PCR试剂及方法，该CODEHOP RT-PCR试剂只用一组引物下，特异性更；用该CODEHOP RT-PCR试剂检测狂犬病毒属时间较短，方法简便，灵敏性高，且可以确认具体基因型，以及鉴定狂犬病毒属内的未知病毒或可能出现其他基因型的病毒。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种检测狂犬病毒属的CODEHOP RT-PCR试剂，包括引物溶液，所述引物溶液中含有核苷酸序列为5’-TTTGTTTTCT GACAAGAATG ACAAATatha ayathaa -3'的上游引物KQZ1，和核苷酸序列为5’-TTTTGCTGCA TGTCTAACTT Cttgrtcnac cca -3'的下游引物KQZ2，上述序列中其中h含义为a或c或t/u，y含义为c或t/u，r含义为g或a，n含义为g或a或c或t/u或其它。 

检测狂犬病毒属病毒的方法，其步骤如下：

a、RNA提取：用RNA提取试剂盒（购自Qiagen公司）提取病毒的RNA，得到RNA，具体提取方法依说明书进行；

b、RNA逆转录：用RNA逆转录试剂盒（购于Promega公司）对上述RNA进行RNA逆转录，得到PCR模板，具体逆转录方法依说明书进行：在0.2mL eppendorf管中加入oligo d(T)₁₅ primers（50mM）1μL，上述RNA 10μL，72℃ 10.min ，再加入反应试剂，20μL反应体系中AMV反转录酶终浓度为0.5U/μL，RNA酶抑制剂终浓度为0.5U/μL，dNTP终浓度为0.5mM，4μL RT-buffer 5 ×，反应条件为42℃60min，72℃10min；反应产物即为后续的PCR模板；

c、PCR反应：在0.2mL eppendorf管中加入10×PCR缓冲液（PCR buffer）2.5μL、浓度为25mM的 MgCl₂溶液1.5μL、浓度为10mM的 dNTP液0.5μL、浓度为5U/μL的Taq酶液 0.5μL、含浓度都为25μM的上游引物KQZ1和下游引物KQZ2的引物溶液1μL、上述PCR模板2μL，灭菌去离子水16μL，组成PCR反应体系；反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃ 延伸1min，35个循环，72℃延伸7min，4℃保存PCR产物；