[发明专利]一株嗜乙酰乙酸棒杆菌及其产丁二酸的方法

权利要求书

1.一株嗜乙酰乙酸棒杆菌（Corynebacterium acetoacidophilum）YF/Δldh，已于2012年2月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO：M2012041，其特征为乳酸脱氢酶基因ldh缺失菌株。

2.根据权利要求1所述的ldh基因缺失菌株，其特征是使嗜乙酰乙酸棒杆菌缺失ldh基因的方法包括以下步骤：

（a）以嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870基因组为模板，利用PCR法分别扩增ldh基因上、下游片断，其中，上游片断的引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，下游片断的引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，再采用重叠PCR法，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.4为引物，以ldh基因上、下游片断为摸板，将ldh基因上下游片断连接起来，形成ldh基因缺失片段，ldh上游片段序列为SEQ ID No.5，ldh下游片段序列为SEQ ID No.6；

（b）将此ldh基因缺失片段插入载体pK19mobsacB，构建ldh基因敲除载体，命名为pK19mobsacB-Δldh；

（c）将构建的ldh基因敲除载体导入嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870，分别通过卡那抗性和蔗糖抗性筛选培养基的筛选，得到缺失ldh基因的嗜乙酰乙酸棒杆菌的克隆菌YF/Δldh。

3.一种利用嗜乙酰乙酸棒杆菌YF/Δldh生产丁二酸的方法，其特征是在好氧条件下，25-37℃培养12-48小时，然后将所得的菌体细胞转入以葡萄糖为底物，碳酸盐为二氧化碳供体的缺氧环境中，于25-37℃下继续培养30-100小时。

4.根据权利要求3所述的嗜乙酰乙酸棒杆菌YF/Δldh生产丁二酸的方法，其特征是YF/Δldh的好氧条件，培养基组分为以g/L计：葡萄糖 20-60，尿素0.5-5，酵母膏0.1-5，酪蛋白1-10，(NH₄)₂SO₄ 2-20，KH₂PO₄ 0.1-1.5，K₂HPO₄ 0.1-1.5，MgSO₄·7H₂O 0.1-1.5，MnSO₄·H₂O 0.0004-0.005，FeSO₄·7H₂O 0.001-0.06，硫胺素 0.00005-0.0005，生物素 0.00002-0.0005，pH 7.0～7.2。

5.根据权利要求3所述的嗜乙酰乙酸棒杆菌YF/Δldh生产丁二酸的方法，其特征是嗜乙酰乙酸棒杆菌YF/Δldh的缺氧环境，培养基组分为以g/L计：葡萄糖50-400，碳酸盐30-500，KH₂PO₄ 0.1-1.5，K₂HPO₄0.1-1.5，MgSO₄·7H₂O 0.1-1.5，MnSO₄·H₂O 0.0004-0.005，FeSO₄·7H₂O 0.001-0.06，硫胺素 0.00005-0.0005，生物素 0.00002-0.0005，pH 7.0～7.2。

6.根据权利要求3所述的嗜乙酰乙酸棒杆菌YF/Δldh生产丁二酸的方法，其特征是所述菌体细胞，是好氧培养后的菌体，或好氧培养后离心的菌泥制成的固定化细胞。