[发明专利]一种重组艾塞那肽的生产工艺

权利要求书

1.一种重组艾塞那肽的生产工艺，包括工程菌的构建、工程菌的发酵表达和目的蛋白的纯化，其特征在于：所述的工程菌的构建是按下述步骤进行的：

（1）重组Exendin－4多肽基因序列的人工合成：根据大肠杆菌密码子偏爱性，设计编码Exendin－4的核苷酸序列，改造为如SEQ ID No.1所示的目的基因；

（2）MAG2010质粒：取pET31b(+)质粒，切割掉SEQ ID No.2所示KSI融合基因片段，更换为SEQ ID No.3所示的基因，删除限制性内切酶AlwnI酶切位点和蛋氨酸和后继序列，取代以肠激酶酶切位点和目的蛋白的基因，切割掉组氨酸标记序列，在GB1蛋白的前面添加组氨酸标记，在目的蛋白的羧基末端添加双终止子；

（3）工程菌的构建：按照启动子-6X组氨酸-GB1-tag-肠激酶的裂解位点-exedin-4-双终止密码子 的顺序得到的基因片段，利用CloneEZ试剂盒连接到已经切割好的MAG2010质粒中，得到重组质粒pET-31(b+)-Exendin-4，将重组质粒pET-31(b+)-Exendin-4以CaCl₂法转化受菌体BL21(DE3) plays，在37℃下在LB培养基中进行培养，收集菌体，筛选阳性克隆，作为重组Exendin-4融合表达的工程菌pET-31(b+)-Exendin-4/ BL21(DE3) plays。

2.根据权利要求1所述的重组艾塞那肽的生产工艺，其特征在于：所述的工程菌的发酵表达包括下述步骤：

（1）挑单菌落到装有30 mL 目标培养基中，31℃，200rpm活化过夜；

（2）将30mL菌液接到200 mL 2XYT培养基中，32℃，200rpm 培养约2.6 hr；

（3）以10％的接种量，接到5 L MMBL培养基中，32℃，240rpm培养约3 hr；

（4）接到60 L发酵培养基中；

（5）控制生长期pH为6.8；用搅拌速度及通气量使DO≥10% ；待培养基中葡萄糖的浓度降至0.2g/L时开始补料；当OD₅₅₀达到10左右时加入13 mL 1M IPTG诱导，终浓度为0.2mM，把pH缓慢调至7.00，继续培养10 小时后结束。

3.根据权利要求1或2所述的重组艾塞那肽的生产工艺，其特征在于：所述的目的蛋白的纯化步骤采用离子交换层析-柱层析-三明治型的亲和层析进行分离和纯化；该工程菌经过发酵、纯化得到的重组艾塞那肽的产量达到500毫克/升的产率。

4.根据权利要求3所述的重组艾塞那肽的生产工艺，其特征在于：所述的三明治型的亲和层析包括亲和层析一、酶裂解和亲和层析二，具体步骤如下：

（1）亲和层析一：采用GE 公司的IgG- sepharose-fast flow column,首先用3个柱体积的50 mM Tris，pH 7.5，150 mM NaCI的缓冲液平衡柱子，然后用将用相同缓冲液透析过的蛋白质上柱，用1倍体积上述缓冲液洗然后用5mM 乙酸钠，pH5.0的缓冲液洗去未结合的杂质，接着用500mM 乙酸钠，pH5.0的缓冲液将目的蛋白洗脱下来，收集、浓缩，用足量的20mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH7.6 透析12小时；

（2）肠激酶处理：1 μl的重组牛肠激酶轻链亚基在20℃，20mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH7.6的条件下8h可以完全切割融合蛋白；

（3）亲和层析二：将上述处理过的重组Exendin-4结合在镍柱上，先用起始缓冲液冲洗脱磷酸盐缓冲液，保留洗脱组分，浓缩，冷冻干燥，得到重组的艾塞那肽。