[发明专利]焦磷酸测序法检测CYP19A1基因多态性的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及焦磷酸测序法检测CYP19A1基因多态性的试剂盒及方法。

背景技术

芳香化酶(Aromatase Enzyme)属于细胞色素P450酶超家族成员，编码基因为CYP19A1，定位于15q211。为醛固酮、皮质醇、雄激素生物合成不同阶段所必须的酶。CYP19A1可催化睾酮、雄烯二酮向雌酮、雌二醇转化，在雌激素生物合成中起最终的限速催化作用，因而又称雌激素合成酶。

芳香化酶抑制剂(Aromatase inhibitors，AIs)通过抑制芳香化酶，使雌激素水平下降，从而消除雌激素对肿瘤生长的刺激作用。绝经后妇女的雌激素主要来源于雄激素前体物质在外周组织的芳香化，故该类药物主要用于自然绝经或人工绝经后的乳腺癌患者。由于其选择性较高，不影响糖皮质激素、盐皮质激素和甲状腺功能，大剂量使用对肾上腺皮质类固醇类物质分泌无抑制作用。按照作用机制的不同，AIs分为两类：甾体类及非甾体类。甾体类AIs包括第一代的睾内酯、第二代的福美坦和第三代的依西美坦。非甾体类AIs包括第一代的氨鲁米特、第二代的法屈唑和第三代的阿那曲唑、来曲唑。依西美坦是甾体类AIs，具有雄激素结构，与CYP19A1的底物雄烯二酮竞争，不可逆结合于CYP19A1催化中心，导致酶活性丧失。阿那曲唑和来曲唑属于非甾体类AIs，与CYP19A1中的亚铁血红素可逆性结合，对酶的抑制程度可达99％以上。

临床研究已证实CYP19A1的基因多态性对芳香化酶抑制剂在乳腺癌的治疗效果有着很大的影响作用。在接受来曲唑治疗的绝经后激素受体阳性转移性乳腺癌患者，携带CYP19A1基因rs4646(G＞T)突变患者的的疾病进展时间(TTP)比正常者明显延长(17.2月：6.4月，P＝0.02)。因此，CYP19A13’端非翻译区(3’-UTR)SNP突变(rs4646G＞T)是乳腺癌患者接受芳香化酶抑制剂治疗疗效的有效预测指标。

综上所述，CYP19A1基因多态性可作为芳香化酶抑制剂疗效预测的有效指标，开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测CYP219A1基因多态性的试剂盒将为芳香化酶抑制的临床个体化治疗起到积极的推动作用。

焦磷酸测序(Pyro sequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。

发明内容

本发明旨在提供一种焦磷酸测序法检测CYP19A1基因(SEQ ID NO.1)多态性的试剂盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测芳香化酶抑制个体化用药相关基因SNP。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

一种焦磷酸测序发检测CYP19A1基因多态性的试剂盒，包括如下引物：

(1)扩增引物：

上游引物：5′-TCAAACTCTTGGCCTCTGCTTT-3′(SEQ ID NO.2)；

下游引物：5′-TGGCCCATGGCATTTTATAGG-3′(SEQ ID NO.3)；

其中，下游引物的5′进行生物素标记；

(2)测序引物：5′-CCAAGCTAGGTGCTATT-3′(SEQ ID NO.4)；

试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。

一种应用上述试剂盒检测CYP19A1基因多态性的方法，包括如下步骤：

(1)DNA提取；

(2)聚合酶链反应：

配制50μl PCR扩增体系，包含：10×PCR buffer 5.0μl，dNTP 2.0μl，CYP19A1-上游引物0.5μl，CYP19A1下游引物0.5μl，rTaq0.5μl，水39.5μl，模板2μl；按照下面的循环参数设置扩增仪：95℃5min预变性；然后依次在95℃30S，53℃30S，72℃30S，进行36个循环；再在72℃保持5min，最终保持在4℃，得扩增产物；

(3)焦磷酸测序单链样本纯化；

(4)焦磷酸测序及结果分析。

本发明的试剂盒对CYP19A1rs4646(G＞T)目标序列，该目标序列包括：野生型CCCTGGAAGG(SEQ ID NO.5)和突变型CGCTGGAAGG(SEQ ID NO.6)；扩增出的片段长为127bp。