[发明专利]一种适用于超薄切片和荧光成像的生物样品制备方法

权利要求书

1.一种适用于超薄切片和荧光成像的生物样品制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将生物样品用冰水预冷却的浓度为4％的多聚甲醛固定液固定6～24小时；

(2)将步骤(1)得到的生物样品用冰水预冷却的漂洗液清洗3～24小时，其间更换新鲜漂洗液3次；

(3)将步骤(2)得到的生物样品依次放入冰水预冷却的浓度为50％，70％和95％乙醇溶液中进行梯度脱水，每次15分钟到2小时；

(4)将步骤(3)得到的生物样品依次放入冰水预冷却的浓度为70％，85％和100％的乙二醇甲基丙烯酸酯(GMA)水溶性包埋液中进行梯度渗透，每次渗透1～3小时，随后再次放入新鲜的浓度为100％的GMA水溶性包埋液中渗透6～12小时，最后在预聚的GMA水溶性包埋液中渗透1～3天；

(5)将步骤(4)得到的生物样品放入充满预聚的GMA水溶性包埋液的包埋模具中隔氧包埋，然后置入58℃～60℃烘箱中聚合36～60小时。

2.根据权利要求1所述的适用于超薄切片和荧光成像的生物样品制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的固定液由浓度为4％多聚甲醛粉末，2.5％蔗糖和0.01 MOL/L PBS配制而成。

3.根据权利要求1所述的适用于超薄切片和荧光成像的生物样品制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中若生物样品的尺寸若过大，先切成2厘米见方的组织块后再后固定。

4.根据权利要求1所述的适用于超薄切片和荧光成像的生物样品制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中漂洗液由浓度为0.38％甘氨酸、2.5％蔗糖和0.01MOL/L PBS配制而成。

5.根据权利要求1所述的适用于超薄切片和荧光成像的生物样品制备方法，其特征在于，所述步骤(4)浓度为100％的GMA水溶性包埋液由67克GMA单体，3克水，30克甲基丙烯酸丁酯和0.6克过氧化苯甲酰配制而成。

6.根据权利要求1所述的适用于超薄切片和荧光成像的生物样品制备方法，其特征在于，所述步骤(4)和(5)中的GMA水溶性包埋液中添加有NaOH溶液，使GMA水溶性包埋液的PH值为8～9.5。

7.根据权利要求1所述的适用于超薄切片和荧光成像的生物样品制备方法，其特征在于，所述步骤(4)和(5)中的预聚的GMA水溶性包埋液配制方法为：取浓度为100％的GMA水溶性包埋液放入锥形瓶中，用称量纸和橡皮筋封口后插入一根水银温度计，并接触瓶底，将锥形瓶放到加热磁力搅拌器上加热搅拌，当水银温度计指示温度至115℃～120℃时迅速将锥形瓶放入冰水浴中，并大力摇动，直至溶液温度降至冰浴的温度。

8.根据权利要求1所述的适用于超薄切片和荧光成像的生物样品制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中包埋模具为具有隔氧功能的包埋模具，所述具有隔氧功能的包埋模具可以为凝胶胶囊和BEEM胶囊。

9.根据权利要求1所述的适用于超薄切片和荧光成像的生物样品制备方法，其特征在于，所述(5)中若没有隔氧功能的包埋模具，在无氧条件下包埋生物样品，然后将包埋模具放入密闭的盒子中，最后再放入烘箱中聚合。

10.根据权利要求1至9任一项所述的适用于超薄切片和荧光成像的生物样品制备方法，其特征在于，所述生物样品可以为荧光蛋白标记的动物组织。