[发明专利]微孔板、微孔板模块及实时监控微孔板上温控反应的方法

说明书

技术领域

本发明属于通过温度控制的化学或生化反应的领域，特别是一种微孔板、微孔板模块及实时监控微孔板上温控反应的方法。

背景技术

许多应用科学如分子生物学，遗传病诊断，法医，食品科学等当中，只有少量的DNA可供分析, 直接检测非常困难。聚合酶链反应（PCR）能够从微量DNA样本中生产出大量可用于测序和基因分型的复制DNA片段,使DNA检测成为可能,从而使之成为非常有价值的技术。 

在PCR过程中，试剂通过温度循环在每个周期中对原始DNA片段进行复制倍增。每个温度周期通常由三步构成：（1）变性（~95°C）；（2）退火（~50°C）；（3）扩展/延伸（~70°C）。

有两个重要的因素对PCR检测来说非常关键：一是置放在微孔板中的样品能快速达到其温度设定点以便在较短的时间内能完成整个测试；二是对于每个温度设定点，反应模块保持微孔阵列所有微孔反应温度的均匀度。

在筛选实验，统计分析，或大型检测项目实施过程中，在相似的试验条件下能同时处理许多样品最为理想。最常见的PCR样品盘（微孔板）的构造是带有一个硬实的、以二维型式开有许多微孔的顶吊框架，通常包括12x8（共96孔）格式，24x16（共384孔）格式。如美国专利 No.6015534（珀金－埃默尔公司Perkin-Elmer, 埃特悟Atwood） 所述, 微孔设计通常是锥形的（图 8A－B）,便于从温度控制模快中压入和取出。温度控制模快中的匀热模块有相匹配的加工成的锥形空腔。温度控制模快底面通常包括一个控制加热和冷却的电热模块，或者通过加热或冷却液流通于靠近底部加工成型的通道，从而实现温度控制的目的。

这样的温度控制模快设计上相当复杂和昂贵，为了达到所要求的均匀加热/冷却条件，微孔板必须具有锥形孔以使之与空腔的几何形状完全匹配。其它不足还包括：通向样品的传热要需要较长一段时间，因为它必须从热源底部上行一段距离才能到达微孔的顶部部位; 由于微孔底部达到温度设定点要比顶部早，导致了样品溶液从上至下有不同的加热/冷却的历史。从光学性能的角度来看，这样的设计结构也远远欠佳，因为激励光和发射荧光都必须穿过整个微孔的深度，这会明显导致光强衰减。

对这样的设计方案近年已经有了一些改进。美国专利申请No.2010/0055743 A1（博奥瑞实验室Bio-Rad Laboratories,Inc., 班讷纪Banerji)所提出的一个范例是， 对温度控制模快进行改进并通过减少其体积来改善反应时间。这样的小改进使热单元的设计和制造更加复杂，从而造成额外成本。而且这还不能解决微孔在不同深度加热和冷却不均匀的问题。 

市场上产品的另一种设计方案是使用玻璃毛细试剂管。装有样品溶液的细长玻璃管置于环形的温度控制模块里面，通过具有温度可控的空气把对流加热/冷却空气流吹入到该玻璃管环型阵列中, 以实现温控条件。为了获得良好的传热效果，这种玻璃管必须非常薄，这就使得它相当脆弱易碎；出于其同样考虑，玻璃管横截面必须尽量小，使得它难以注入样品溶液并影响均匀度。此外，这种设计在提升生产规模、加大样品数量时都有一定困难。

为了进一步提高PCR热模块的性能，也有人提出了一些其它解决方法。例如，美国专利No.5459300(卡斯曼Kasman) 所介绍一种方案是在微孔板和温控表面之间加上一层导热兼容层，用以适应不同微孔板底部的几何形状（扁平形、U形、V形）。这种兼容层即使添加了导热填料，与铝，铜金属相比，通常热性能也很差，它也引进了额外的热界面，所有这些因素都将导致系统热响应时间慢。此外，在垂直负荷压力作用下，传热对兼容层的厚度变化非常敏感，在这种环境下很难控制这个参数，这将导致微孔之间加热不均匀和响应时间不一致。此外，大多数微孔板产品都未对微孔底部传热进行优化，这有可能进一步恶化系统的热性能。

美国专利No.7074368（鲁尔茨Lurz等）所介绍的另一种方法是使用一个与样品单元相接的静态微孔板，让数个恒温单元（设定在不同的温度）与其底面相接触。如何使接触面实现有效的热接触从而达到最佳化（低接触热阻、整个表面上均匀性）显然是一个挑战。这种解决方案仍然存在传统设计那样的热响应慢、均匀性差的问题。

还有一些其它平底结构型式的微孔板，例如美国专利No.6232114（奥罗拉公司Aurora Bioscience Corporation,寇尔辛Coassin等）所介绍的方案，主要是解决光学通透性的问题，而不是解决PCR过程中所遇到的热响应和均匀性问题。