[发明专利]无载体骨髓间充质干细胞膜片的制备方法

权利要求书

1.一种无载体骨髓间充质干细胞膜片的制备方法，其特征是：

首先，用贴壁法将骨髓间充质干细胞培养于培养皿中，隔天全量换干细胞培养基一次，待骨髓间充质干细胞完全融合后，再培养7天以上作为待用的骨髓间充质干细胞；

然后，取待用的骨髓间充质干细胞，用不含二价阳离子的缓冲液冲洗2次以上，在培养皿中加入配置好的二价阳离子螯合剂，待骨髓间充质干细胞膜片脱离培养皿，去除培养皿中的螯合剂，即获得无载体骨髓间充质干细胞膜片；

最后，将无载体骨髓间充质干细胞膜片用干细胞培基冲洗2次以上，再加入干细胞培基保存。

2.根据权利要求1所述的无载体骨髓间充质干细胞膜片的制备方法，其特征是：所述不含二价阳离子的缓冲液为PH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)或D-Hank’s液。

3.根据权利要求1所述的无载体骨髓间充质干细胞膜片的制备方法，其特征是：所述配置好的二价阳离子螯合剂为浓度在0.01％～0.004％之间的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征是：所述乙二胺四乙酸(EDTA)配置方法为将20mg乙二胺四乙酸(EDTA)溶于100mlPH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)或D-Hank’s液中配置成浓度为0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，再将0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)溶液稀释，获得浓度范围在0.01％～0.004％之间的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液。

5.根据权利要求1所述的无载体骨髓间充质干细胞膜片的制备方法，其特征是：加入乙二胺四乙酸(EDTA)溶液后，培养皿周边的骨髓间充质干细胞首先脱离培养皿，脱离的骨髓间充质干细胞与相邻骨髓间充质干细胞相连形成片状，骨髓间充质干细胞脱离范围从周边逐渐向中央发展，最终完全脱离，形成无载体骨髓间充质干细胞膜片，随骨髓间充质干细胞的脱离，无载体骨髓间充质干细胞膜片逐渐缩小变厚。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征是：35mm大小的培养皿完全脱离时间为40秒～1分钟，脱离后无载体骨髓间充质干细胞膜片面积大小为皿底的1/3，无载体骨髓间充质干细胞膜片所含细胞数量为10⁶数量级。

7.一种如权利要求1～6中任意一种方法制得的无载体骨髓间充质干细胞膜片，其特征是：无载体骨髓间充质干细胞膜片的细胞密度大；可以有效避免因载体代谢所产生的不良作用；无载体骨髓间充质干细胞膜片经胰酶消化、培养后，其增殖能力、形态及活性无明显改变。