[发明专利]绵羊K71皮肤毛囊特异性启动子及其克隆

说明书

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及一种绵羊皮肤毛囊特异性启动子及其克隆，具体涉及一种皮肤毛囊特异性表达基因角蛋白71(K71)5’调控区特异性启动子的克隆分析。

背景技术

基因的表达和基因的功能不仅是分子生物学研究的核心内容(这里基因的概念不仅仅是指编码蛋白的DNA序列)，也是分子生物学技术应用的关键环节。转录调控在基因表达中占有很重要的地位，其调控机制也非常复杂。其中，启动子与调控转录起始的转录因子相互作用，严格控制着基因表达(转录)的起始时间、地点和表达丰度的高低，决定了基因转录的组织特异性和表达强度，所以启动子的复杂而精细的调控是机体维持正常生理活动的基础和前提。随着基因工程的发展，常常需要构建一种能高水平、组织特异性表达外源蛋白质的表达载体。启动子对外源基因的表达水平影响很大，因此也就成为基因工程表达载体的重要元件。

在开展毛囊发育中基因表达的调控机制、培育目标基因在毛囊特异性高效表达转基因细毛羊等研究中，非常需要获得皮肤毛囊组织特异性表达的启动子指导目标基因的表达，从而准确地分析和评价不同的目标基因对皮肤毛囊发育、发生和生长的功能和作用。这些基础研究工作不仅能丰富对毛囊发育的调控机制的认识，而且也为细毛羊生产中培育细毛羊优良品种、提高羊毛产量、改善羊毛品质提供科学依据。

角蛋白71是毛囊内根鞘的重要组成蛋白，利用全基因组关联分析证明了K71是控制毛发弯曲的主要基因。然而，在羊上目前还没有相关的研究报道，该基因的报道序列只有编码区的部分序列。通过克隆获得绵羊K71启动子序列，构建K71皮肤毛囊毛皮质外源基因特异性表达载体，不仅能用于毛发弯曲、毛囊发育中基因表达调控机制的研究，而且对转基因细毛羊的培育也起到了促进作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种绵羊K71皮肤毛囊特异性启动子及其克隆，首先通过染色体步移克隆绵羊K71基因5’调控区的序列，进一步研究发现其具有组织特异性启动子的调控活性。该启动子具有皮肤毛囊表达的特异性，仅在皮肤毛囊中能够特异性地启动其下游基因的表达，满足目标基因在皮肤毛囊中特异性的表达，为皮肤毛囊特异性表达载体的构建及转基因羊的生产奠定了基础。

其技术方案如下：

本发明所提供的绵羊皮肤毛囊特异性表达K71基因5’调控区启动子，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，并通过报告基因分析确定了该启动子的特征。

首先，通过染色体步移的方法获得绵羊皮肤毛囊特异性表达K71基因5’调控区序列，长度为3.7kb，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

然后，通过报告基因荧光素酶基因来分析启动子的活性和组织特异性。通常，在不改变受体细胞的生理活动条件下，通过检测启动子下游的报告基因的表达情况，就可以知道启动子表达与否、比较启动子表达强弱。其中，荧光素酶基因就是动物细胞、个体模型最常用的报告基因。因此，我们将绵羊皮肤毛囊特异性表达K71基因5’调控区序列(长度为3.7kb)插入到pGL3 Basic载体中，得到启动子报告基因的分析载体，同时以pGL3-CMV载体作为阳性对照，pGL3 Basic载体(无启动子载体)作为空白对照，分别转染绵羊原代成纤维细胞和小鼠C2C12成肌细胞。48小时后利用多功能酶标仪检测荧光素酶活性，以此评价启动子的活性及其组织特异性。具有上述序列的启动子或者截短的序列，具有皮肤毛囊特异性的启动活性，而在皮肤细胞之外的细胞中没有活性，可见该启动子在皮肤毛囊中特异性的启动下游基因的表达，能够满足目的基因在皮肤毛囊特异性的表达要求，能应用于毛发弯曲、毛囊发育中基因表达调控机制的研究以及转基因羊的培育。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：研究证实，含本发明的启动子具有皮肤毛囊组织特异性表达的活性。实验中，仅在人表皮角质化细胞中检测到荧光素酶的活性，而在皮肤毛囊细胞之外的细胞中没有检测到显著的荧光素酶的活性。说明克隆得到的K71基因5’启动子调控区序列只能在皮肤毛囊中特异性地启动下游基因的表达，能够满足目的基因在皮肤毛囊特异性的表达要求，能应用于转基因羊的培育。

附图说明

图1是扩增绵羊K71基因5’调控区结果图，(其中：M为150bp marker，1为第一轮扩增产物，2为第2轮扩增产物，3为第三轮扩增产物)；

图2是扩增绵羊K71基因5’调控区结果图，(其中：M为1kb marker，1，2为K71的扩增产物)；

图3是K71皮肤毛囊组织特异性启动子在不同类型细胞中活性评价结果图