[发明专利]家蚕表皮蛋白BmCP274启动子及其重组表达载体和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种组织特异性启动子及其表达载体和应用。

背景技术

家蚕在天然条件下产出的丝纤维是一种在纺织工业、生物医学等领域具有广泛应用的纤维材料。蜘蛛与家蚕具有相似的纺丝体，但其产出的丝纤维却较蚕丝具有更强的硬度和更出色的韧性。丝纤维在生物体内的形成是一个极其复杂的过程，至今都没有获得完全阐明。现有的合成纤维都是人工模拟昆虫天然产丝的过程，在体外进行合成，但是其力学性能还远不能和蜘蛛丝纤维进行对比。如果能使家蚕高效、特异地产出大量优质的类蜘蛛丝纤维，对于优质纤维材料的获取具有非常重要的意义。家蚕前部丝腺是向列型液晶形成的场所，离子强度对丝纤维的形成具有重要作用。利用家蚕前部丝腺特异启动子过量表达外源蛋白例如家蚕前部丝腺的某些离子通路蛋白，可能使丝纤维性质发生改变，获得更加优良的蚕丝纤维。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种家蚕表皮蛋白启动子及其重组表达载体和应用，该启动子可以使外源蛋白在家蚕前部丝腺特异性表达，利用该启动子在家蚕前部丝腺调控某些离子通路蛋白的表达，可能使丝纤维性质发生改变，获得更加优良的蚕丝纤维。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、家蚕表皮蛋白BmCP274启动子，由SEQ ID No.1所示核苷酸序列组成。

2、含有所述家蚕表皮蛋白BmCP274启动子的重组表达载体。

进一步，所述重组表达载体为pBac[BmCP274-表达基因-SV40, 3xP3EGFP]，是将由家蚕表皮蛋白BmCP274启动子、表达基因序列和SV40终止信号组成的表达框[BmCP274-表达基因-SV40]插入穿梭载体pSLfa1180fa的多克隆位点中，获得重组载体pSL[BmCP274-表达基因-SV40]，再用Asc I从重组载体pSL[BmCP274-表达基因-SV40]中切下[BmCP274-表达基因-SV40]片段，与同样经Asc I酶切的载体pBac[3xP3-EGFPafm]连接，即得。

进一步，所述表达基因为红色荧光蛋白DeRed基因。

3、所述家蚕表皮蛋白BmCP274启动子作为家蚕前部丝腺特异性启动子的应用。

本发明的有益效果在于：本发明利用蛋白质组学手段鉴定到一个在家蚕前部丝腺特异并且高量表达的表皮蛋白BmCP274，对其启动子序列进行了克隆，并以DsRed基因为代表基因构建了由BmCP274启动子调控的DsRed表达载体，将该表达载体显微注射入家蚕体内获得了转基因家蚕阳性个体，对该转基因家蚕阳性个体的研究发现，BmCP274启动子驱动DsRed在家蚕前部丝腺特异表达，因此，BmCP274启动子可以作为家蚕前部丝腺特异性启动子应用。利用BmCP274启动子在家蚕前部丝腺调控某些离子通路蛋白的表达，可能使丝纤维性质发生改变，获得更加优良的蚕丝纤维，从而本发明为下一步研究通过调控家蚕前部丝腺的离子通路蛋白表达来影响家蚕吐丝行为和改良丝纤维性能打下了基础，而本发明提供的含有BmCP274启动子的重组表达载体为上述研究提供了有力的工具。

附图说明

图1为BmCP274启动子转基因家蚕不同时期在白光和荧光照射下的照片，其中a和b分别为白光和荧光照射下的卵，c和d分别为白光和荧光照射下的成虫，e和f分别为白光和荧光照射下的家蚕茧壳。

图2为BmCP274启动子转基因家蚕的丝腺解剖图，其中a和b分别为白光和荧光照射下的转基因家蚕丝腺，c和d分别为白光和荧光照射下的非转基因家蚕大造丝腺。

图3为BmCP274启动子转基因家蚕的Southern blot分析，其中1为Tran 2K plus DNA Marker，2为经Bgl Ⅱ酶切的非转基因家蚕大造蚕蛾DNA，3为经Bgl Ⅱ酶切的转基因家蚕G1代蚕蛾DNA，4为增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因（阳性对照）。

图4为BmCP274启动子转基因家蚕在前部丝腺特异表达DsRed的Western blot分析，其中1为转基因家蚕前部丝腺蛋白，2为非转基因家蚕大造前部丝腺蛋白。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例中使用的家蚕品种为大造，由中国西南大学家蚕基因资源库提供。