[发明专利]一种大豆高效遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种大豆高效遗传转化方法。

背景技术

大豆[Glycine max(L)Merr.]是重要的经济作物和油料作物，它的遗传转化研究一直受到学者们的广泛关注，而主要瓶颈问题是转化效率低。

现有的大豆遗传转化方法包括农杆菌介导法、电击法、PEG转化法、基因枪法、花粉管通道法等，比较成熟的是基因枪介导的体细胞胚转化法和农杆菌介导的子叶节转化法。

1988年Christou等首次将基因枪法应用于大豆愈伤组织的遗传转化，但未获得再生植株，同年McCabe等利用基因枪法转化大豆芽分生组织，获得了转基因植株，但大都为嵌合体。此后，基因枪轰击法主要应用于大豆未成熟胚或体胚悬浮细胞系，能稳定获得转基因植株，但转化效率都较低，而且存在再生植株周期长和转基因植株败育等缺点。

1998年Hinchee等首次报告了根癌农杆菌(Agrobacterium tumfaciens)介导法成功转化大豆的事例，后来不少学者采用这种方法进行大豆子叶节转化研究，都获得了转基因植株，但转化效率都比较低，而且嵌合体较多。

发明内容

本发明的目的是提供一种大豆高效遗传转化方法。

本发明提供了一种大豆高效遗传转化方法，依次包括如下步骤：

(1)通过基因枪轰击法将含有目的DNA的质粒导入大豆外植体；

(2)通过农杆菌介导法将所述含有目的DNA的质粒导入完成步骤(1)的大豆外植体。

所述大豆外植体可为胚尖外植体，具体可为大豆成熟种子胚尖外植体(大豆萌动种子胚尖外植体)。

所述大豆成熟种子胚尖外植体的制备方法依次包括如下步骤：(1)将灭菌后的成熟大豆种子在无菌水中室温浸泡24小时；(2)在无菌条件下去掉种皮，取下胚轴连同刚萌动的胚尖；(3)将下胚轴连同刚萌动的胚尖摆放在预培养培养基上，胚尖垂直向上，25℃-28℃培养24小时，然后去除原叶(叶原基，发育后形成真叶)，得到外植体(即大豆成熟种子胚尖外植体)；所述预培养的光照条件为16小时光照、光照强度150μmol m^-2s^-1，8小时黑暗。

所述预培养培养基具体为含3.5mg/L 6-苄氨基嘌呤和30g/L蔗糖的MS-B₅固体培养基。

所述大豆具体可为K06-82大豆或科丰28号大豆。

所述基因枪轰击法中，基因枪轰击的参数具体可为：金粉直径大小为1.0μm，真空度26～28英寸汞柱，氦气压力为1100psi，轰击距离为6cm，每皿轰击2次(第一次轰击后平皿旋转90°再轰击第二次)，每次轰击1μg所述含有目的DNA的质粒。具体可采用Bio-Rad PDS1000/He基因枪。

所述农杆菌介导法具体可为：将完成步骤(1)的大豆外植体在重组农杆菌菌悬液中28℃黑暗条件下振荡培养20小时；所述重组农杆菌是将所述含有目的DNA的质粒导入农杆菌得到的重组农杆菌。所述农杆菌具体可为农杆菌GV3101。所述重组农杆菌菌悬液具体可为OD_600nm＝0.45-0.5的菌悬液。所述重组农杆菌菌悬液具体可通过如下方法制备：将所述重组农杆菌重悬于培养基丁，得到重组农杆菌菌悬液。所述培养基丁为含6mg/L6-苄氨基嘌呤、200μM乙酰丁香酮、30g/L蔗糖和10g/L葡萄糖的1/2MS-B₅液体培养基。乙酰丁香酮可以增加转染效率。

以上任一所述方法均可用于制备转基因大豆。

所述大豆具体可为K06-82大豆或科丰28号大豆。

本发明还保护一种制备转基因大豆的方法，依次包括如下步骤：

(I)将出发大豆进行以上任一所述的遗传转化；

(II)依次进行共培养、恢复培养、筛选培养和生根培养，得到转基因大豆。

所述大豆具体可为K06-82大豆或科丰28号大豆。

所述共培养具体可为在共培养培养基上，22℃暗培养4天。所述共培养培养基具体可为含6mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.154g/L二硫苏糖醇、0.2g/L Na₂S₃O₃、1mg/L AgNO₃、1g/LL-半胱氨酸、200μM乙酰丁香酮、30g/L蔗糖和10g/L葡萄糖的1/2MS-B₅固体培养基。乙酰丁香酮可以增加转染效率。所述共培养培养基可以防止褐化和提高转化效率。