[发明专利]含组氨酸标签重组人内皮抑素质谱绝对定量方法

权利要求书

1.一种含组氨酸标签重组人内皮抑素的生物样品提取方法并建立其质谱定量方法，具体步骤如下：

A、生物样品制备方法：

将含金属Ni²⁺琼脂糖凝胶加入离心柱，冷冻离心机离心去除液体；加入平衡液离心冲洗两次；含重组蛋白血浆加入，4℃涡旋混匀20min，加入平衡液洗两次，加入杂质洗脱液，最后加入蛋白洗脱液洗脱目的蛋白；将提取后的蛋白洗脱液用离心超滤方法置换为消化缓冲液，再加入2μL胰蛋白酶溶液，涡旋混合，37℃孵育12小时得酶解样品，加入2μL酶解反应终止液和2μL内标溶液后用于质谱定量；

B、LC-MS/MS检测方法：

色谱条件为：岛津SLC-20A型液相色谱系统；色谱柱：安捷伦300SB-C8柱，3.5μm，150mm×2.1mm；流动相：A：含体积百分比0.1％甲酸的水，B：乙腈，梯度洗脱；柱温40℃，流速：0.2mL/min；进样量10μL；质谱条件为：API 4000型三重四极杆串联质谱仪，配有电喷雾离子化源和Analyst 1.3数据处理软件；离子源：电喷雾离子化源；正离子方式检测；电喷雾电压为5500V；温度550℃；源内气体1：氮气压力40PSI；气体2：氮气压力60PSI；气帘气：氮气压力25PSI；DP：90V；CE：40V；扫描方式为多重反应监测；特异性肽段多重反应监测设定值，Q1：802.3，Q3：651.8；内标肽段多重反应监测设定值，Q1：816.9，Q3：666.4。

2.根据权利要求1所述的含组氨酸标签重组人内皮抑素质谱绝对定量方法，其特征在于所述的平衡液是含有20mM咪唑，500mM氯化钠的0.1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，pH 7.6；杂质洗脱液是含有80mM咪唑，500mM氯化钠的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，pH 7.6；蛋白洗脱液是含有500mM咪唑，500mM氯化钠的0.1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，pH 7.6；所述的消化缓冲液，是0.1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，pH 7.6；所述的胰蛋白酶溶液，是100μg/mL的胰蛋白酶溶液；所述的酶解终止液，是20％的甲酸水溶液；所述的内标溶液，是1μg/mL的合成肽段内标水溶液。